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生物物理技术综述荧光光谱(FluorescenceSpectroscopy)韩荣成(10303023)北京大学,03级生物医学工程一、背景知识：1.荧光，是指物质在吸收紫外光后发出的波长较长的紫外荧光或可见荧光，以及吸收波长较短的可见光后发出波长较长的可见荧光。除了紫外荧光和可见荧光，还有红外荧光、X射线荧光等。在很多情况下，分子从激发态回到基态过程中，能量通过热量等形式散失到周围。但是在某些情况下，能量能以光子发射的形式释放出来。分子的能量状态在光学分析中涉及的分子能量有：E0=Ee+Ev+Er，其中Ee:价电子运动能（electron）；Ev：原子在平衡位置的振动能（vibration）；Er：分子绕其重心的转动能（rotation）。Ee大约为1eV数量级；Ev大约为10－1～10－2eV；Er大约为10－4～10－5eV数量级，可见⊿Ee⊿Ev⊿Er分子吸收能量后，处于激发态的分子通过非辐射过程丢失能量，首先到达S1的昀低振动能级，这一过程称为内转换（internalconversion）,发生在10－11s内。从S1的昀低振动能级以光子形式放出能量而回到基态的不同振动能级，这一过程称为荧光（fluorescence）,发生在10－9s内；如果以非辐射的形式丢失能量则称为淬灭（quenching）。如果某种物质在被某种波长的光照射以后能在较长的时间内发出比1生物物理技术综述荧光波长更长的波长的光，则称这种光为磷光。磷光产生的机制与荧光是不同的，虽然它们都属于发射光谱，但磷光不是处于第一电子激发态的昀低振动能级的分子直接释放出光子回到基态的结果，而是从某种能量低于第一电子激发态的昀低振动能级的另一种亚稳能级⎯三重态向基态的各振动能级以辐射方式产生跃迁时发出的光。所谓三重态或三线态，是指分子中电子自旋量子数S=1，即原来两个配对的自旋方向相反的电子之一自旋方向改变，以至电子自旋之和不为0的情况。处于第一电子激发态昀低振动能级的分子，有可能通过无辐射跃迁(系间交连，intersystemcrossing)消耗部分能量，其中一个电子的自旋方向倒转，从而处于三线态。从三线态的昀低振动能级向基态的各振动能级跃迁并释放出光子，则其发光为磷光。由于三线态的电子自旋和不为零，这种跃迁是一种被禁跃迁，即跃迁几率很小。这样，在三线态停留的时间即寿命就比较长(从10-3秒到数秒)，强度很弱。由于三线态能量低于第一电子激发态昀低振动能级，因此磷光的波长比荧光长。二、荧光光谱：荧光光谱包括激发谱和发射谱两种。激发谱是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率；发射谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况，也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。激发谱既然是表示某种荧光物质在不同波长的激发光作用下所测得的同一波长下荧光强度的变化，而荧光的产生又与吸收有关，因此激发谱和吸收谱极为相似，呈正相关。由于激发态和基态有相似的振动能级分布，而且从基态的振动能级跃迁到基态各振动能级的几率也相近，因此吸收谱与发射谱呈镜象对称关系.λex:maximumexcitationwavelength;λem(λax):maximumemissiowavelength昀低振动能级跃迁到第一电子激发态各振动能级的几率与由第一电子激发态的昀低n2生物物理技术综述2.荧光光谱仪和主要谱参数2．1荧光光谱仪荧光谱仪结构上的昀主要特点是入射的激发光与荧光探测方向垂直。1.光源：现在多用氙灯，氙灯在200-800nm范围内具较好的发射谱。2.入射光单色器：入射光单色器是用来选择特定波长的单色光，入射到样品上。荧光分光度计中采用光栅作为单色器。激发波长择描就是靠它来改变波长。3.监视探测器：这个探测器用来监测光源的恒定性。4.光闸：光闸关闭时，入射光被挡住，不能照到样品上，这样可以防止样品长期受到照射而产生化分解。另外，在打开样品室的盖时，关上光闸，可以防止读数过大，给图笔撞击端部。5.样品杯：样品杯是10mm×10mm的石英杯，四面透明，且用去荧光石英材料制成。注意荧光样品杯不能用紫外谱仪中的样品杯代替。6.发射光单色器：用来选择一定波长的光进入探测器测量。发射光择描就是用它来实现的。7.计算机辅助记录系统：用以完成绘图及荧光强度的测量。2.2主要的谱参数2．2．1荧光寿命(fluorescencelifetime)去掉激发光后，分子的荧光强度降到激发时昀大荧光强度的1/e所需要的时间，称为荧光寿命，常用τ表示:τ=1/k――――――（1）证明：It=I0e-kt其中I0是激发时昀大荧光强度，It是时间t时的荧光强度，k是衰减常数。假定在时τ时测得的It为I0的1/e，则τ是我们定义的荧光寿命。3生物物理技术综述01IeIt=则有：τ=1/k如果激发态分子只以发射荧光的方式丢失能量，则荧光寿命与荧光发射的速率常数成反比，速率常数即为单位时间中发射的光子数，因此有τF=1/KF。KF是速率常数。τF表示荧光分子的固有荧光寿命，kF表示荧光发射过程的衰减常数。如果除荧光发射外还有其它释放能量的过程(如淬灭和能量转移)，则寿命τ还和这些过程的速率常数有关，结果是荧光寿命降低。由于吸收几率与发射几率有关，τF与摩尔消光系数εmax(单位为cm2mol-1或(moldm--3)-1cm-1)也就密切相关，从下式可以得到τF的粗略估计值(单位为秒)。1/τF≈104εmax在讨论寿命时，必须注意不要把寿命与跃迁时间混淆起来。跃迁时间是跃迁频率的倒数，而寿命是指分子在某种特定状态下存在的时间。通过量测寿命，可以得到有关分子结构和动力学方面的信息。2．2．2荧光量子产率(quantumyield)：荧光量子产率是物质荧光特性中昀基本的参数之一，它表示物质发射荧光的本领。荧光量子产率通常用φ来表示，定义为发射量子数和吸收量子数之比，即由荧光发射造成的退激分子在全部退激分子中所占的比例，又称为荧光效率。φ＝发出量子数/吸收量子数。处于激发态的分子，除了通过发射荧光回到基态以外，还会通过一些其它过程回到基态。其结果是加快了激发态分子回到基态的过程(或称退激过程)。φ=τ/τF证明：总的退激过程的速率常数k可以用各种退激过程的速率常数之和来表示:k=kF+∑kiki表示各种非辐射过程的衰减速率常数。则总的寿命τ为:τ=1/k=1/(kF+∑ki)因此，量子产率又可以表示为∑+=iiFFFkKKφ因为1/kF=τF，τ=1/(kF+∑ki)所以φ=τ/τFφ的绝对值是较难用实验的方法测量的，因为必须事先知道仪器的修正因子。实际测量中大多采用相对法，即用已知量子产率的标准样品与待测样品进行比较。证明：对稀溶液来说，荧光强度F与吸收度A成正比:F=kI0Aϕ这里k是比例常数，I0是吸收前的光强度，φ是荧光量子产率。若两种溶液测量条件完全相同，则:F1/F2=A1φ1/(A2φ2)φ1/φ2=F1A2/(F2A1)已知φ2就可求出φ1。由于各种竞争性过程而使荧光量子产率减小的现象称为淬灭(quenching)，如温度淬灭，杂质4生物物理技术综述淬灭等。量子产率对于生色团周围的环境以及各种淬灭过程很敏感。量子产率的改变必然会引起荧光强度的改变。因此，如果只要研究量子产率的相对值，只要量测荧光强度也就足够了。2．2．3荧光强度：荧光强度F取决于激发态的初始分布IA与量子产率φ的乘积。Ｆ=IAφ这里的F指的是向各个方向上发射的荧光强度的总和，实际上，谱仪收集的只是其中的一小部分。因此仪器测到的荧光强度Ｆ=IAφZ，这里Z是仪器因子。椐据Beer-Lambert定律（A=KCL，朗伯-比耳定律同时反映了溶液厚度L和浓度C对光吸收A的关系,其数值随光的波长、溶液浓度和溶液的性质而定）IA=I0-It=I0{1-exp[-2.3ε(λA)·C·l]}式中ε(λA)为激发波长处的消光系数，Ｃ为样品分子的浓度，I0为入射光强度，I0为透过样品后的光强度，l为光程（样品池光径）。对于稀溶液，吸收很稀，ε(λA)很小−2.3ε(λA)C·l＜＜1，因此，1-2.3ε(λA)C·l≈exp(-2.3ε(λA)C·l)IA=I0(1-(1-2.3ε(λA)C·l))=2.3I0ε(λA)C·lFλ=IAφZ=2.3I0ε(λA)C·l·ϕ·Z如果激发光强保持不变，且ϕ和Z与激发波长无关，则F∝ε(λA)很显然，荧光强度与样品在波度λA处的消光系数有关，而消光系数与激发波长是密切相关的，消光系数随波长的变化即吸收谱，因此荧光强度也随激发波长的变化而变化。激发谱与吸收谱的正相关关系在此一目了然。当然，实际上仪器因子Z与波长是有关的，这就使得激发谱与吸收谱并不完全相似。2.2.4荧光偏振（fluorescencepolarization）偏振片：吸收某方向光振动，而与其垂直方向的光振动能通过的装置偏振化方向：能通过光振动的方向自然光通过偏振片后变为线偏振光，称为起偏;线偏振光:光矢量只沿一个固定方向振动的光(又称平面偏振光)利用偏振片检验光线的偏振化程度，称为检偏E光矢量振动面荧光偏振度P＝（I//-I⊥）/(I//+I⊥)荧光各向异性A=(I//-I⊥)/(I//+2I⊥)可以证明I//+2I⊥为荧光总强度，（1/P-1/3）-1=(2/3)A5生物物理技术综述偏振片0I偏振化方向Perrin公式：1/P±1/3=(1/P0±1/3)(1+3τ/ρ)=(1/P0±1/3)(1+RTτ/ηV0)其中，P0为极限偏振度，τ为荧光寿命，R气体常数，T绝对温度，η为粘滞系数V0为分子体积（按球形计算），ρ旋转迟豫时间。研究大分子性质以及与小分子的相互作用。不同生理条件下生物大分子的P不同，可以借此诊断疾病。3讨论：（1）环境因素对λmax的影响：a.环境(如溶剂)的极性对λmax的影响---同一种荧光物质在不同极性的环境中，其λmax可能会有所差别。一般来说，激发态的极性比基态要强，因此被激发的荧光分子将趋向于与极性溶剂（或极性环境）相互作用，使溶剂分子的电子分布会发生变化，偶极子重新取向，而这又会反过来影响荧光分子的基态和激发态能级，减少激发态的能量，引起发射谱的红移这种影响的结果可以用Lippert方程来解释：32*22)(1211212annhcfaµµεεσσ−⎟⎟⎠⎞⎜⎜⎝⎛−−−−−≅−＋常数其中，σa与σf分别为荧光分子的吸收波数与发射波数，σa−σf反映了吸收光与发射光能量的差别；ε为溶剂的介电常数；h为普朗克常数；c为光速，a为荧光分子在溶剂中所占空穴的半径，µ∗与µ分别为荧光分子处于基态和激发态时的偶极矩。由上式可见，折射率增加使能量差减少，而介电常数增加会使能量差增大。由于荧光分子激发态的偶极矩µ∗一般要大于基态偶极矩µ，荧光分子偶极矩的增大与溶剂分子相互作用，使溶剂分子的电子分布和偶极子取向发生变化。溶剂偶极子的重新取向需要比电子重新分布长得多的时间。介电常数ε不仅与偶极子取向有关，也与电子取向有关，上式中第一项(ε−1)/(2ε−1)是电子和偶极子重新取向的结果；折射率n与电子重新分布有关，因此上式中第二项是电子重新分布的结果。由于非极性溶剂分子没有偶极矩，因此没有在激发态荧光分子的作用下偶极子重新取向的问题，ε≈n2，σa−σf很小。而在极性溶剂中σa−σf较大，产生红移.值得提出的是“环境极性加强，λmax红移”的规律，并不是绝对的。例如，如果在激发态的寿命之内，分子没有足够的时间来重新排列并降低激发态的能量，则可能发生λmax兰移的情况。这种现象称为“orientationconstraint”。这说明在利用λmax作为环境极性的探针时要十分谨慎。b.pH值对λmax的影响：6生物物理技术综述如果荧光物质为弱酸或弱碱，则溶液pH值的改变常对λmax有影响。这是因为弱酸和弱碱分子和其离子在电子结构上有所不同，因而荧光λmax也可能发生变化。例如，1-萘胺-5-磺酸在不同pH值时，会以两种不同离子的形式存在，这两种离