激光共聚焦显微镜技术1

激光共聚焦显微镜技术ThetechniquesandapplicationsofConfocalLaserScanningMicroscopy激光共聚焦显微镜(LSCM)的发展简史1957年，MarvinMinsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美国的专利。1978年，阿姆斯特丹大学的G.J.Brakenhoff首次展示了改善了分辨率的共焦显微镜。1985年，WijnaendtsvanResandt推出了第一台对荧光标记的材料进行光切的共焦显微镜激光共聚焦显微镜(LSCM)的发展简史80年代末，各家公司都推出了商品化的共焦显微镜,英国的Bio-Rad公司的MRC系列，德国Leica公司的TCS系列，Zeiss公司的LSM系列等。近二十年来，从滤片型到光谱型，人们对共焦高分辨率，采集图像快速，技术的改进及应用开发不断进行，出现了很多新的技术。如双光子，FCS,FLIM,STED等。共焦显微镜的优点人眼分辨率：0.2mm光学显微镜分辨率：0.25μm电子显微镜分辨率：0.2nm共焦显微镜分辨率：μm共焦显微镜的优点电子显微镜的缺陷：1.只能观察固定样品2.样品制备过程（固定、包埋、切片）造成的假象荧光显微镜的缺陷:1.可以观察活细胞或组织，但细胞或组织内结构高度重叠。2.荧光具有强散射性，造成图像实际清晰度的大大下降。3.荧光漂白很快，使荧光图像的拍照有困难。4.如果荧光滤片选配不当，多荧光标记样品图像的采集很困难，且很难抑制光谱交叉。共焦显微镜的优点共焦显微镜与传统显微镜的区别1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜与传统显微镜的区别2.具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜与传统显微镜的区别3.增加侧向分辨率激光扫描共焦显微镜技术FluorescentMicroscopevsconfocal激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术扫描方式激光扫描共焦显微镜技术原理小结:Confocal利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔内，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即为共焦点，被探测点所在的平面即为共焦平面。计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。只要载物台沿着Z轴上下移动，123452alconventionconfocaldd将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光切图像。激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜的设计特点:1.点照明。2.具有照明pinhole和探测pinhole。3.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦),共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面。4.具有扫描系统——逐点扫描成像。5.具有多个（五个）荧光通道，可同时探测多个被标记物。6.使用AOTF(Acousto-OpticalTunableFilter)进行激光波长和强度的选择，并以极超快速控制激光开和关，从而实现任意形状感兴趣区域扫描的功能,实现了实时快速检测。7.AOBS(Acousto-OpticalBeamSplitter)：更好的减少了激发光对发射荧光的干扰。8.光谱检测器：任意选择接受光谱的波长和带宽。AOBS(Acousto-OpticalBeamSplitter)AOBS的作用特定波长的激发光经过AOBS后发生偏转进入光路样品产生的荧光直接通过AOBS到达检测器，而反射回来的激发光经过AOBS后发生偏转不能到达检测器。优点：与传统的二色光分光镜相比，增大了荧光的接受率。更好的阻止了激发光对发射荧光的干扰。光谱检测器棱镜分光，光谱检测激光扫描共焦显微镜技术分辨率1.光学分辨率只与物镜的数值孔径NA和检测波长有关xy分辨率比传统显微镜小1.4x传统显微镜:Rxy=0.61/NA（0.25m)Confocal:Rxy=0.4/NA（0.18m)2.采样分辨率固定物镜倍率下，Zoom相同时，无论采样密度大小，采样面积是固定的。理论上，固定面积下，采样密度越高，即采样点越多，图像越细腻。但是，采样密度越高，扫描一幅图像的速度越慢，荧光强度越低，样品也越容易被淬灭。激光扫描共焦显微镜技术图像亮度1.与物镜NA有关。物镜镜像亮度与数值孔径的平方呈正比，与总放大率的平方呈反比。L=NA2/M2,NA大小相同，倍率越高，镜像亮度越低2.与pinhole大小有关。M2=(M1×M2)2Pinhole大小的选择理论上，最佳Pinhole＝AiryDisk＝1实际上，应根据样品标记的实际情况来选择Pinhole的大小3.与激发光强度有关。4.与接受发射荧光波长的带宽有关激光扫描共焦显微镜技术光切厚度和光切步距光学切片厚度取决于:物镜的NA、针孔大小、发射波长等光学切片厚度＝光切步距(StepSize)dz=Z轴的最小移动步距:40nm，15nm，3nm理论Z轴分辨率：dz=0.35m激光扫描共焦显微镜技术样品的最大厚度:大约1-2mm(10X/0.4物镜)取决于:物镜的NA、物镜的工作距离激光的穿透力、样品的透明度Z轴的最大移动范围(SP2166m、Z-wide,8mm)(sp5500/1500m,-11mm/2mm,15nmstepsize）在观察较厚的样品，如脑片时，应该选用怎样的物镜？激光扫描共焦显微镜技术技术指标（LeicaTCS):1.xy分辨率比传统显微镜小1.4x传统显微镜:Rxy=0.61/NA（0.25m)Confocal:Rxy=0.4/NA（0.18m)2.样品的最大厚度:大约1-2mm(10X/0.4物镜)取决于:物镜的NA、物镜的工作距离激光的穿透力、样品的透明度Z轴的最大移动范围(166m、Z-wide8mmsp2)(500um/1500um/3nm,Z-wide13mmSp5)3.样品的最小光切厚度:(载物台最小移动距离为40nm,SP2）取决于:物镜的NA、针孔大小、发射波长等Z轴的最小移动步距:40nmZ轴的分辨率:0.35m激光扫描共焦显微镜技术Pinhole（探测针孔）大小影响:1)图像的亮度(0.88em)2(n2Ph)2NAn-(n2-NA2)1/2+2)光学切片的厚度Pinhole大小的选择理论上，最佳Pinhole＝AiryDisk＝1实际上，应根据样品标记的实际情况来选择Ph的大小。激光扫描共焦显微镜技术4.激光器Ar激光器:458nm,476nm,488nm,514nmGreNe:543nm;HeNe:633nmAr激光器(UV):351nm,361nm固体激光器：561nm,405nm激光器的特点:1)方向性好:激光基本延直线传播2)单色性好:=10-8nm3)高亮度:激光方向性好,其在空间上的能量分布是高度集中的。4)偏振性:激光为平面偏振光,光纤耦合。5)光谱的不连续性。激光扫描共焦显微镜技术5.五个荧光通道,一个透射光通道即除了可同时采集多标记荧光图像外还可以同时采集透射光图像，但透射光图像为非共焦图像。注：对未标记的标本，可采集反射光图像。激光扫描共焦显微镜技术扫描速度:CONVENTIONAL2800lines/s5125125/SResonant16000lines/s51251225/S扫描密度:6464128128512512，51264，512321024102420482048SP58192819240964096扫描方式：xyz,xyt,xzt,xt，xyzt,xy,x,xz,xzy,xyz,激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜的类型：1.点(慢)扫描共焦显微镜:分辨率高,图像清晰;噪音低;采集图像速度慢;目镜中观察不到共焦图像2.线(狭缝)扫描共焦显微镜(videorate)分辨率低;噪音高;扫描速度快240幅/秒;目镜中可观察到共焦图像3.Nipkov转盘式扫描共焦显微镜性能介于上述两者之间SpinningdiskconfocalSpinningdiskconfocalSpinningdiskconfocal•每个视场约1000个激光点，总计约20000个针孔•针孔尺寸固定在50μm，适合100x/1.4油镜•针孔间的空隙可避免信号相互干扰•约有70%的激发光到达样品•盘转速1500到10000转/秒，成像速度300到2000帧/秒•激发光谱400-650nm检测光谱420-750nmSpinningdiskconfocal采用双转盘,微透镜EMCCD作为探测器采样速度快，300－2000/s适合于记录活细胞样品的快速变化没有电子放大，不适合观察细胞内的微细结构。发射波长使用滤片选择。激光扫描共焦显微镜技术的应用TheapplicationofConfocalLaserScanningMicroscopy激光扫描共焦显微镜技术的应用Confocal基本应用FRET、FRAP和FLIP应用与Confocal相关技术的进展激光扫描共焦显微镜技术的应用功能.1.多重荧光标记样品的高清晰度、高分辨率图像采集2.无损伤、连续光学切片，显微“CT”3.真正的三维重组4.假三维图的显示5.可沿Z轴（xy平面）和Y轴（xz平面）方向进行光切6.定量分析7.时间序列扫描:xyt、xyzt和xt扫描8.图像处理9.旋转扫描10.感兴趣区域扫描11.光谱扫描－光谱拆分荧光强度的测量荧光强度＝荧光效率×激发光强度测量原理(Boehm1861)I=I0Q(1-10-kcd)＝I0Q(1-1/10kcd)I0:激发光强度；I:发射光强度Q:荧光量子产率，对于特定荧光物质，该值为常数。当c较小时，IC若用计算机采集荧光图像，计算机灰度级可直接代表荧光强度。旋转扫描除用于xy平面旋转以调整样品的方位之外，主要用于xt线扫描方式。由于只沿x方向扫描一条线(相当与在x方向的512个点)，已经丢失了很多空间信息，如果这时所被扫描的细胞长轴与x方向不一致，将更进一步丢失空间信息。为此，需进行旋转扫描，旋转扫描即可以使扫描方向旋转到与细胞长轴一致，然后沿细胞长轴方向进行扫描。激光扫描共焦显微镜技术的应用感兴趣区域扫描一般情况下，激光扫描共焦显微镜系统扫描的区域形状通常是固定的方形或长方形，如果x方向和y方向的采样点数相同，如：512×512，256×256，128×128，则扫描区域的形状为方形。如果x方向和y方向的采样点数不同，如：512×64，则扫描区域的形状为长方形。而感兴趣区域扫描是使用者可以根据实际情况，用鼠标勾画任意形状感兴趣的区域进行扫描。感兴趣区域扫描还可以用于荧光漂白恢复测量及荧光能量共振转移时淬灭区域的选择。激光扫描共焦显微镜技术的应用光谱拆分如果两种荧光标记物光谱在同一个检测通道接受的波长范围内具有高度重叠时，往往两种荧光信号同时进入同一个检测器，此时从所采集的图像中完全无法区分两种荧光标记物，如：FITC与GFP，FITC与Fluo3在500～530nm范围内高度重叠，或者植物细胞中自发荧光与任何一种荧光标记物在每一个检测通道光谱的高度重叠时，需要利用光谱拆分的功能将两种荧光标记物区分开。因每一种荧光标记物都有自己独特的光谱特性，如同每一个人都有自己的指纹。通过光谱扫描（或指纹分析）可以将同一通道的一副混合图像拆分成两种不同的荧光物质标记的图像。