紫外吸收法测定核酸含量

实验十六紫外吸收法测定核酸含量目的要求学习紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度的原理。实验原理核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性质，其吸收高峰在260nm波长处。核酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用来表示。为每升溶液中含有1克原子核酸磷的光吸收值（即A值）（表）。测得未知浓度核酸溶液的A260nm值，即可以计算出其中RNA或DNA的含量。该法操作简便，迅速，并对被测样品无损，用量也少。试剂和器材•试剂：•钼酸铵－过氯酸沉淀剂：取3.6mL70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4mL蒸馏水中，即成0.25%钼酸铵－2.5%过氯酸溶液。•5-6%氨水：用25-30%氨水稀释5倍。•材料酵母RNA干粉。请节约使用。每八个同学用一份，即50ml/8人1.准确称取待测核酸样品0.5g，加少量0.01mol/LNaOH调成糊状,再加适量水，用5-6%氨水调至pH7.0，定容至50mL。2.取两支离心管，甲管加入2mL样品溶液和2mL蒸馏水，乙管加入2mL样品溶液和2mL沉淀剂。混匀，在冰浴上放置30min。3.在3000r/min下离心10min。从甲、乙两管中分别吸取0.5mL上清液，用蒸馏水定容至50mL。选择厚度为1cm的石英比色杯，在260nm波长处测定A值。4.测定A280的值。求出A260/A280.判断RNA的纯度。RNA=A260/A280=2.0操作方法二、计算公式ΔA260RNA浓度=xN0.024xL式中，ΔA260为甲管稀释液在260nm波长处A值减去乙管稀释液在260nm波长处A值；L──比色杯的厚度，1cm；N——为稀释倍数；0.024──每毫升溶液内含1μgRNA的A值；1mL待测样品液中核酸（微克）核酸％＝1mL待测样品液中制品的毫克数在本实验中，1mL待测液中制品量为50μg。1.紫外分光光度计使用前要预热。2.比色皿应成套使用，注意保护,不能拿在光面上。3.离心机使用前必须将离心管平衡，对称放置。调速必须从低到高，离心完等转子完全停下后，再打开盖子，然后将转速打到最低。注意事项1．干扰本实验的物质有哪些？2.设计排除这些干扰的实验。思考题