第九章农药生物测定

LOGO第九章农药的生物测定LOGO一、生物测定的基本原理和内容概念•农药生物测定是指用活体生物对农药的毒效、毒性进行的测定评价。是测定药剂有无生物活性的基本方法。•农药生物测定与室内毒力测定一般没有严格区别，多半是指在室内进行的测定。LOGO•包括利用标准供试生物对农药有效成分含量的测定•农药在室内外对病虫草药的测定•农药在动、植物体内残留量的测定•对病虫草抗药性的测定。LOGO生物测定的基本原理•利用生物体对农药的反应性质和程度来鉴别和测定农药的生物活性及其相关性，即对昆虫、病原菌杂草及高等动物毒性、作用方式、作用程度，用以比较毒力或药效。LOGO主要研究内容主要研究内容•综合其在农药研究和植物化学保护应用中的作用，生物测定包括：室内毒力测定、田间药效试验和微量毒物的定量生物分析。LOGOA室内毒力测定•1、活性化合物的筛选（初筛/复筛），主要研究大量化合物的活性筛选。•2、有害生物的抗性研究•研究农药的作用机理及生理效应，以及农药对植物的生理作用等。•3、测定农药的有效含量及残留量。•4、研究农药理化性质和剂型与毒效的关系。•5、农药复配的共毒系数测定。LOGOB田间药效试验•田间药效试验是在自然或一定的人为控制条件下进行的生物测定，是一种综合评价药剂使用价值的试验方法。是一种新化合物能否成为农药的关键性阶段。LOGO•田间药效试验可分为：•小区试验•大区试验•大面积示范试验•其中小区和大区药效试验都是在有限的范围和面积内进行的，有一定的局限性，通常还要进行大面积示范试验以取得验证并迅速推广。LOGO•田间药效试验包括以下内容•（1）农药品种比较试验•（2）不同剂型比较试验•（3）农药应用技术试验•（4）农药（剂型）的理化特征与药效的关系•（5）对寄主植物的药害及对生物群落的影响，尤其是对害虫天敌的影响试验。LOGO二、试验设计原则和步骤LOGO（一）试验设计原则•1．相对控制环境条件•（1）室内生物测定多属单因子试验。如：控制施药剂量，靶标生物的死亡率，控制试验的温湿度条件等。•（2）田间试验多因子试验设计，对于大面积的试验区难以形成人工控制的条件，仅能对土肥、病虫分布、长势等进行小区控制。加强田间管理，尽可能避免与试验无关因素的影响LOGO•2．设立对照，消除试验中的偶然误差•在农药试验中通常所设的对照有：•（1）空白对照•（2）溶剂和乳化剂试验•（3）标准药剂试验LOGO•3．各处理设立重复，减少误差•从生物统计的理论上讲，重复次数越多，其平均值就越接近真实值，试验结果也越可靠，但工作量太大。通常在生物测定中，每处理设3～5个重复，每重复采样数因测定对象而定：如某种杀虫剂对小菜蛾的毒力测定，每处理可用30～50头3龄幼虫。LOGO•4．统计分析试验结果•运用生物统计分析原理，总结归纳实验数据，化繁为简，找出规律，科学地反映出农药与病虫害间的内在联系，给出结果。主要用显著性测定（方差分析，t值或F值测定）。LOGO•（二）设计步骤•1．选择合适的试验对象•2．确定药剂的用量（浓度）及用法（点滴、浸渍、喷雾、药膜等）•3．确定试验结果的观察方法，如LD50、ED50、LC50等指标•4．确定试验设计方案•5．试验的实施•试验结果的生物统计分析LOGO第二节杀虫剂室内毒力测定LOGO•杀虫剂的室内毒力测定是不断地开发新的有效杀虫剂，改善和提高现有杀虫剂的使用效果，减少环境污染的必要手段。测定所得结果是安全、合理、经济、有效的使用杀虫剂的依据；可有效监测害虫的抗性动态，有利于克服害虫抗药性以及保持自然环境的生态平衡。LOGO•主要的研究内容包括：•（1）测定杀虫剂对昆虫的效力。•（2）筛选新农药及探索新化合物的化学结构与毒效关系的规律（即构效关系的研究，较多地运用于计算机辅助开发新农药的过程）。如溴氰菊酯有8种异构体，但只有右旋顺式体对昆虫的毒效最高。六六六的8种异构体中，也只有丙体666的毒效最高。•（3）研究杀虫剂的理化性状与毒效的关系及鉴定加工剂型的质量。•（4）研究目标昆虫的生理状态及外界条件与药效的关系。•（5）测定不同杀虫剂混用的效力以及寻找增效剂等。LOGO一、标准试虫的饲养•杀虫药剂的室内毒力测定，需要虫态、龄期、营养及生活力状况良好和发育一致的大量昆虫作材料。而从田间采集的昆虫生理生化状态（虫龄、抗性水平等）往往差异较大，测得的结果误差很大，不符合试验要求。因此，必须在实验室内大量饲养标准化的试虫。LOGO•常用的室内饲养的试验昆虫种类很多，可根据不同的试验目的，选择不同的虫种进行饲养。昆虫的室内饲养的环境应尽量满足该试虫的最适发育温度、湿度、光照等条件。饲养的饲料可分为天然饲料和人工饲料。一般以人工饲养来代替天然饲料，以便长期长期稳定的供给昆虫饲养的需要。LOGO棉铃虫的饲养•棉铃虫（HelicoverpaarmigeraH.）属鳞翅目夜蛾科。食性杂，可长年饲养。但因幼虫在三龄期以后有相互残杀习性，须单头饲养。连续大量饲养可采用人工饲养。LOGO（1）人工饲料配方•A．含大豆粉和玉米粉的饲料•（a）饲料组成•熟大豆粉（g）20.0玉米粉（g）30.0•大麦粉（g）30.0抗坏血酸b）0•干酵母（g）8.0琼脂（g）3.5•苯甲酸钠（g）0.8棉油（ml）0.5•36％醋酸（ml）6.010％甲醛（ml）1.0•水（ml）200LOGO•（b）配制方法大豆粉蒸熟。将甲醛、棉油和苯甲酸钠放在占总水量10％的水中，再加入玉米粉等其他成分搅拌；加另外90％的热水，以溶解琼脂，冷至70℃时与上述组分混合搅拌；饲料均匀平铺在瓷盘上，厚度0.5—1.0cm，冷却后切成重5g左右小块，分装于养虫管中备用。LOGO•B．含棉叶粉的饲料•（a）饲料组成•干棉叶粉（g）7.0尼泊金（g）0.25•熟豆粉（g）7.5琼脂（g）1.5•多维葡萄糖（g）1.9自来水（mL）600•抗坏血酸（g）1.9酵母片（粉）（g）4.5LOGO•（b）配制方法将黄豆粉置高压灭菌锅内，经30分钟灭菌（15磅压力），取出凉干备用。把酵母片研成粉末，置紫外线灯下灭菌30分钟。将琼脂放入200ml水中加热熔化，再加入400ml水、熟豆粉、多维葡萄糖、抗坏血酸、尼泊金、干制棉叶粉，充分拌匀后，分装于指形管中，每管10g左右。•（2）饲养方法将初孵幼虫移入装有人工饲料的指形管中，每管１头，管口盖上棉布，用橡皮筋扎好。幼虫在内取食，直至老熟，勿须再换饲料。幼虫进入预蛹期，即转移到盛有无菌细土的养虫缸内，泥土必须保持湿润，以利入土化蛹和蛹的存活。成虫羽化后，雌雄配对，放入马灯罩中，罩内放一个内有10％蜂蜜液的小瓶，瓶中插入一束上粗下细的脱脂棉条，以便蛾子从棉条上吸取蜜液。马灯罩下铺上纱布，并用橡皮筋扎好。蛾子在罩内交尾产卵，每日将产于纱布上的卵连同纱布取下，并换新纱布和蜜液。有卵纱布放入养虫缸中的饲料上，缸口糊白纸，以防幼虫外逃。或用黑布将缸口封住，布上压玻璃板，缸下部对着光源，孵化的幼虫可很快到饲料上取食。•（3）饲养条件养虫室温度保持26～28℃，相对湿度60％～70％，10小时/天光照。幼虫历期22天左右。LOGO二、供试昆虫的准备•为了使毒力测定的结果可靠稳定，除了严格控制每次试验过程中的条件外，杀虫剂毒力测定要求所用试虫群体质量的均匀一致，除饲养的试虫外，从野外采集的田间试虫，应进行分离和严格挑选，如虫期、龄期、性别等，使之达到群体质量均匀，尽可能地减少试验误差，保证获得满意的结果。移虫前应该净手及消毒，避免药剂或有害病菌污染虫体；操作时要细心，不要碰伤虫体。LOGO•1移取试虫的方法•毒力测定时，首先应将试虫从饲养缸（笼）中快速移出，且不能损伤虫体。根据毒力测定所用的昆虫种类、个体大小、生活习性和特点不同，以及移取的工具和方法的差异可分为机械法，化学法和趋光法。LOGO•1.1机械法•对于菜青虫、斜纹夜娥等活动能力不大或有假死性的试虫，可采用最简单的取虫工具，如镊子来移取。而一些体型小、体软或易碰伤的试虫，如蚜虫、红蜘蛛、小菜蛾等，可用毛笔移取。•一些活动能力不大、微小或易受机械伤害的目标昆虫（如杂拟谷盗、米象、蚜虫和虫卵等）。此类试虫用上述方法移取困难，费时或易造成伤害，可用真空或喉管空气注射吸虫法移取，既方便又快速。LOGO•1.2麻醉法•移取飞翔或活动能力强的试虫时，常采用麻醉法处理，以达到试虫混匀移取的要求。但是麻醉处理对昆虫的生理状态有一定影响，因而要注意麻醉时间，以免对试虫造成伤害。•1.2.1二氧化碳法•用CO2或CO2与空气（3：1）混合气体麻醉法，可用于大多数试虫。可在一个密闭容器里放入试虫，然后通入二氧化碳即可进行麻醉。•1.2.2挥发蒸气法•在密闭广口玻璃容器（如干燥器）中，放入三氯甲烷与酒精（1：1）、三氯甲烷与乙醚（1：1）、乙醚与酒精（1：1）或乙醚等药品，进行麻醉。麻醉时间随各种试虫群体对麻醉剂的敏感性和所要求的麻醉程度不同而定，如家蝇的麻醉时间一般在4min以内。LOGO•1.2.3乙醚低温麻醉法•用试管扣试虫，再用棉花蘸少许乙醚并把乙醚挤干后，封住管口，然后把麻醉的试虫倒放在垫有冰块的器皿上，以保持虫体在冷冻状态，便于操作处理。此法具有麻醉时间短、见效快和无死亡等优点，此法使用于家蝇等飞翔能力强的试虫。•1.2.4冷冻法•适用于蜚螃、家蝇等试虫。一般分两步进行，先将试虫置于5℃条件下冷冻10min，然后移至0℃条件下冷冻2－3min取出。这样冷冻的效果较好，对试虫的生活力无不良影响。该法所需时间较长、需要冷冻设备；在室温20℃以上时，经低温麻醉的试虫，恢复较快，不便对试虫进行分离操作。此外，冷冻处理时间过长，对试虫的生理状态和抗药力均有一定程度的影响，在使用时要注意掌握时间。LOGO•1.3趋光法•用强光照射时，家蝇、果蝇等试虫会向光源群集，利用昆虫的这种趋光性来移取试虫。如家蝇成虫，家蝇从饲养笼中向着阳光或灯光飞到移取笼中。该法移取的试虫均匀性较差，先移出的试虫多为生活力较强的个体，且易造成虫体损伤或飞逃。LOGO三、杀虫剂毒力的表示方法•毒力即是农药的毒性程度。常用的杀虫剂毒力表示方式：•致死中量(MedianLethalDose)，即杀死供试昆虫群体半数个体所需要的剂量，常以LD50表示；•致死中浓度(MedianLathalConcentration)，即杀死供试昆虫群体一半个体所需要的药剂浓度，以LC50表示；•致死中时(MedianLethalTime)或击倒中时(MedianKnockdownTime),即杀死或击倒供试昆虫群体一半个体所需的时间，单位示分钟，记做LT50或KT50。•同时，在不同药剂间毒力比较时，还常常使用LD95或LC95来描述杀虫剂毒力,即杀死昆虫群体95％的个体所需的药剂剂量或浓度。LOGO四、杀虫剂毒力测定的常见方法•杀虫剂对不同种类的害虫毒力程度各异，且致毒的方式也不一样，毒力测定的方法也很多，根据杀虫剂的作用方式可分为四种：胃毒作用、触杀作用、内吸作用和熏蒸作用的毒力测定。LOGO•1．胃毒作用(stomachaction)的毒力测定•利用害虫的贪食性，使杀虫剂随食物一起被目标昆虫吞食进入消化道而发挥毒杀作用。常用的有叶片夹毒法、液滴饲喂法和口腔注射法三种•（1）叶片夹毒法（sandwichmethod）•此法适用于植食性、取食量大的咀嚼式口器的昆虫，如鳞翅目幼虫、蝗虫、玉米螟等。•基本过程是用两张叶片，中间均匀地涂上一定量的药剂饲喂目标昆虫，然后由被吞服的叶片面积推算出吞服的药量。此法最大的优点是可以减少目标昆虫与药剂的接触，避免发生触杀作用，操作方便，结果比较精确，仍然是目前较理想的胃毒剂毒力测定方法。但是准备夹毒叶片、计算吞服面积等需大量的人力物力，每次处理的样品不能太多。LOGO•a.夹毒叶片的准备•将采回的植物叶片用水洗净，待表面水分挥发后，用打孔器制成2cm直径的圆叶片，其中一片的一面定量涂（喷）上药剂，另一片则涂上淀粉糊（或面粉糊），小心地将两片叶片对合制成夹毒叶片。将夹毒叶片按不同剂量饲喂已知体重的目标昆虫。叶片被食后，将剩余叶片移置于