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研究生基础研究实验技术培训系列基因过表达技术小RNA干扰技术基因表达检测技术（包括mRNA与蛋白质)生化与分子生物学常用实验技术介绍三方面有机联系，形成承上启下、相互验证的整体1.表达基因------表达ORF首要步骤：获得目的基因要求得到的目的基因cDNA片断不仅纯度高，而且要扩增达到足够的数量，方可满足生物学或遗传学研究及应用的需求。（1）提取细胞内总RNA（Trizol,RNA提取所有准备环节）（2）分离纯化mRNA(oligo-dT-纤维素亲合柱，optional）（3）反转录合成cDNA(反应体系有mRNA、反转录酶、4种dNTP，及oligo-dT引物)（4）合成cDNA第二链A.从构建好的真核细胞基因组文库筛选目的基因（人类基因组计划完成之前，很流行，但费时费力）B.从NCBI数据库中“钓取”，只需设计目的基因特异性引物组织特异性表达的目的基因：需分离、克隆组织特异性启动子应用：胰腺癌特异性启动子---------------基因工程理想情况：胰腺癌中表达较高，但正常细胞中不表达或表达很低，将促凋亡基因至于其下游，可望实现基因治疗。肠促胰酶肽HER2？Normalcelllines在保留组织特异性表达的基础上，进行基因工程改造，以增强启动子强度为目标。XieXetal.CancerCell2007,12(1):52-65.申请并获得一项美国专利，2012年在美国MDAnderson癌症中心已应用该专利进行胰腺癌治疗的II期临床试验。大多数基因的过表达不涉及组织特异性表达选择CMV强启动子（一般表达载体本身都有）目的基因与载体的连接连接策略：1.粘性末端连接（如EcoRI或HindIII）2.定向克隆（如EcoRI+HindIII）3.平末端连接（EcoRV，或Klenow）4.加人工接头连接5.T-A克隆（T-Acloning）注意：载体是有方向的，而目的片段可以双向与之相连。如果以表达为目的，我们要对插入片段进行方向鉴定。一般构建表达载体都选择定向克隆。转化细菌：将质粒导入受体菌转染细胞：将质粒导入真核细胞不同细胞，质粒进入的效率区别较大。如果目的细胞用质粒很好转染，那就用质粒就可以了，可以少很多实验费用。如果目的细胞不好转，才要用病毒来感染。决定用质粒还是腺病毒的最主要因素，不是表达效率，而是进入细胞的效率。推荐用慢病毒载体介导的基因过表达，转染效率高，并且可以稳定表达，通常对宿主细胞没有毒性。慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基.础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。2.表达载体（1）质粒（2）病毒（逆转录病毒、腺病毒和慢病毒载体等）（抗性基因）目前许多生物公司可提供相关服务。基因表达的整个过程：DNA经转录（transcription）合成信使RNA（mRNA），再以mRNA为模板翻译（translation）成蛋白质。在原核细胞和真核细胞之间，转录的起始与终止、翻译的起始调节因子，以及翻译后的加工过程都是显著不同的。任何一个环节不能正确地进行，均可导致基因表达失败。基因表达产物的检测：1.mRNA------RT-PCR（略）,real-timeqPCR2.蛋白质-------Western印迹法，荧光显微镜检测（略）Westernblot原理与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜，或PVDF转移膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。靠胶滤纸胶膜靠膜滤纸初学者注意：正负极决不能弄错！实时荧光定量PCR：通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。最常用TaqMan荧光探针，它是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关，设计为与目的基因上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在TaqMan探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。举例：ABI7500PCR仪使用96孔板，样品量大，仪器稳定，结果分析直观误差原因：枪的误差（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光性能不一致）所导致的光能损失、仪器稳定性（如孔间、批间温度的波动）Normalization=Reporter/Referenc（内参）CT（阈值循环，ThresholdCycle）是扩增曲线和阈值线的交叉点阈值设定得比基线高，又在扩增曲线的指数增长区域内足够低。阈值必须设在线性期中。当模板量减少时，CT值随之增加。反应混合物或仪器中的任何改变，只要能影响与CT值计算相关的荧光测定，都会使CT值产生非模板依赖性的变化。因此，在不同条件下或用不同试剂进行的PCR反应产生的CT值不可以直接进行比较。各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。对qPCR结果分析应注意：判断扩增曲线是否良好的指标：•曲线拐点清楚，指数期明显；•扩增曲线整体平行性好，基线平而无上扬现象；•指数期斜率越大，扩增效率越高（成正比）；•各反应管扩增效率相近，各管的扩增曲线平行性好荧光定量PCR数据分析用参照基因的ΔCT法，条件是目标基因和参照基因扩增效率都接近100%且相互间效率偏差在5%以内。Ratio(reference/target)=2CT(reference)–CT(target)例子：正常和肿瘤组织50ngRNA得到的cDNA，用来分析p53(目标基因)和GAPDH（参照基因）。样品CTp53(目标基因)CTGAPDH(参照基因)正常(校准样本)15.016.5肿瘤(试验样本)12.015.9为了计算相对表达，对每种样品中的p53的表达量进行归一化对于正常细胞，2(16.5–15)=2.8对于肿瘤细胞，2(15.9–12)=14.9正常组织的表达=正常/正常=2.8/2.8=1肿瘤组织表达=肿瘤/正常=14.9/2.8=5.3因此，肿瘤细胞的p53表达水平比正常细胞高5.3倍实例分析：FATS新基因过表达及检测Mouse-FATSCDS序列(NM_001199941)Mimi-FATS(FATSN-端区域1-363AA)细胞总RNA反转录定向克隆质粒纯化细胞转染表达检测LiZetal.Oncogene2010ZhangXetal.Mol.Cancer2010基因表达检测及功能分析乳腺癌/配对正常组织FATS表达检测:real-timeqPCR结果TianYetal.LungCancer2012ZhangJetal.ChinMed.J2011配对肺癌组织正常组织小分子RNA干扰技术许多高分SCI期刊要求：将基因过表达实验得出的结论--------用小分子RNA干扰实验进行验证！双链核糖核酸能导致转录后基因沉默双链RNA对基因表达的阻断作用被称为RNA干预（RNAinterference,RNAi）双链RNA经酶切后会形成很多小片段，称为smallinterferingRNA(siRNA)，是一种小RNA分子（~21-25核苷酸），由Dicer（RNAaseⅢ家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成。这些小片段一旦与mRNA中的同源序列互补结合，会导致mRNA失去功能，即不能翻译产生蛋白质，也就是使基因“沉默”。siRNA研究历史和原理：1998年，AndrewFire的研究证明，在正义RNA阻断了基因表达的试验中，真正起作用的是双链RNA。这些双链RNA是体外转录正义RNA时生成的。于是提出了RNAi这个词。2006年美国史丹佛大學教授安得鲁．菲尔(AndrewZ.Fire)和麻省大學教授克雷格．梅洛(CraigC.Mello)兩人因发现RNAi共同获得诺贝尔奖。CancerRes.2010随后siRNA与RNA诱导沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)结合，解旋成单链。活化型RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合在标靶mRNA上，引发RNAi效应。Dicer:一种切割dsRNA的核酸内切酶。过去认为，哺乳动物细胞中不存在RNAi现象，因为较长的dsRNA在哺乳动物细胞中能诱导IFN(干扰素)生成，导致非特异性的蛋白质合成障碍；也能激活非特异性的RNA酶L，发生非特异性的RNA降解效应。（上世纪80-90年代一度盛行反义RNA技术，效果有限，特异性不高）现在发现,只要dsRNA短于30bp,就不会促发干扰素效应,同时又能特异性地降解mRNA,引起基因沉默。RNAi技术应用：抑制內源基因表达。RNA干涉是分子生物实验中一项强有力实验工具。其中siRNA是RNAi发挥效应所必需的因子，siRNA设计原则：1.选择区间：起始密码子75-100个碱基以后，终止密码子100个碱基以前的片断。2.GC比例在35-50%之间，最好不要超过。3.避开5′端或3′端的UTRs。4.有义链1位为G或C,19为A或U,即有义链15~19位置至少有3个A或U,或着13~19位置至少有5个A或U。5.siRNA5′端必须磷酸化,3′端悬垂两个dTdT,或是UU。6.利用Blast对照,并进一步用mRNA相似性软件或脱靶控制软件筛选,把脱靶控制到最小水平。7.第16位最好为C,13位最好为非G。shRNA:短发卡RNA(shorthairpinRNA)shRNA干扰载体构建：设计为能够形成发夹结构的非编码小RNA分子，shRNA表达模板是可以克隆到表达载体并表达短的干扰RNA(siRNA,19-21个核苷酸的RNA双链)的DNA分子。可根据靶标设计短发卡RNA(shRNA)序列并将其克隆到特定载体上。载体常采用U6或PolII启动子表达shRNA，目前主要用于慢病毒载体。设计时注意：在正义链和反义链序列上不能出现连续3个或以上的T。这可能导致shRNA转录的提前终止。AdvantageinRNAi：ithasarelativelylowrateofdegradationandturnover.Disadvantage:itrequiresuseofanexpressionvectorwhichcanposesafetyconcerns.限制其在基因治疗方面运用。实例分析：FATS新基因过表达及检测Thankyou