植物组织培养

植物组织培养实验目的植物组织培养是60年代以来植物细胞生物学中发展起来的一项生物技术。它是借用无菌操作方法，培育植物的离体器官、组织或细胞，使其在人工合成的培养基上，通过细胞的分裂、增殖、分化、发育，最终长成完整再生植株的过程。植物组织培养技术的研究，不仅具有重大的理论意义，而且在生产实践中也显示了广阔的应用前景。组织分化与形态建成问题，快速繁殖与去除病毒，花药培养与单倍体育种、幼胚培养与试管受精，抗性突变体的筛选与体细胞无性系变异，悬浮细胞培养与次生物质生产以及超低温种质保存等方面的深入研究和实际应用，都必须借助植物组织培养技术程序和方法，深刻理解植物细胞的全能性。实验用品一、材料枸杞、烟草等植物的叶片。二、仪器高压灭菌锅、超净工作台、烘箱、培养箱或培养室。三、用具镊子、解剖刀、接种针、铝饭盒、锡箔纸、玻璃铅笔或记号笔、橡皮筋。四、玻璃器皿试剂瓶(50、100、1000ml)、三角瓶(100ml)、刻度吸管(0.5、1、5、10ml)、培养皿(直径9-11cm)。五、药品及试剂1.药品（见表21-1）2.70%酒精3.0.1%升汞实验方法一、培养基的配制配制培养基前先要配制母液。母液分大量元素、微量元素、铁盐及有机物质四类。（各类成分、浓度、用量详见下表）。MS培养基母液配制(单位：mg)类别成分规定量称取量母液体积(ml)扩大倍数配1升培养基的吸取量（ml）大量元素KNO3NH4NO3MgSO4·7H2OKH2PO4CaCl2·2H2O190016503701704401900016500370017004400100010100微量元素MnSo4·4H2OZnSO4·7H2OH3BO3KINa2MoO4·2H2OCuSO4·5H2OCoCI2·6H2O22.308.66.20.830.250.0250.025223086062083252.52.5100010010铁盐Na2-EDTAFeSo4·7H2O37.2527.8537252785100010010有机物质甘氨酸盐酸硫胺素盐酸吡哆素烟酸肌醇2.00.40.50.51001002025255000500100101.大量元素母液(10倍液)分别称取10倍用量的各种大量无机盐，依次溶解于大约800ml热的（60-80℃）蒸馏水中。（一种成分完全溶解后再加入下一种，最后加水，定容至1000ml后装入试剂瓶中，冰箱内贮存备用）。2.微量元素母液(100倍液)分别称取100倍用量的微量无机盐，依次溶解于800ml重蒸水中，加水定溶到1000ml。3.铁盐母液（100倍液）称取100倍用量的Na2-EDTA(乙二胺四乙酸钠)和FeSO4·7H2O，溶于800ml重蒸水中，最后定容到1000ml。4.有机物质母液(100倍数)分别称取50倍用量的各种有机物质，依次溶解于400ml重蒸水中，定容至1000ml，装入棕色试剂瓶中，贮存冰箱备用。除上上述四种母液外，培养基中经常附加的各种生物素和细胞分裂素也要配成母液贮存，临用时按浓度定量吸取加入。5.生长素如2，4-D、IAA、NAA等。准确称取20mg，先用2ml95%乙醇溶解，然后加水，定容至20ml，浓度为1mg/ml，再放置冰箱内贮存备用。6.细胞分裂素如激动素(Kt)、6-苄基嘌呤(6-BA)。准确称取20mg，先用2ml的1mol/mlHCL或NaOH溶解，然后加水，定容至20ml，浓度为1mg/ml，再放置冰箱内贮存备用。(二)培养基的配制与分装1.取1000ml烧杯一只，加大量元素10倍母液100ml，微量元素100倍母液10ml，铁盐100倍母液10ml,有机物质100倍母液10ml.此外,根据培养材料和实验目的还要附加一定量的生长素,细胞分裂素及蔗糖等,然后加水至1000ml,待蔗糖充分溶解后用1mol/L的NaOH或HCl调酸碱度为pH5.8,最后加入琼脂粉6.5g,如用琼脂条,则要加8g。2.将盛有培养基的烧杯放入高压锅中，上盖牛皮纸一张，盖上高压锅盖，蒸煮半小时左右，待琼脂完全融化后取出，分装到培养用三角瓶中，每只100ml三角瓶约装40ml培养基。分装时要避免把培养基倒在瓶口上，否则培养时容易引起杂菌污染。3.把锡箔纸裁成适当大小的长方形，背靠背折起来，使成正方形，紧密裹在瓶口上，随后便可进行灭菌。培养基的种类和附加成分是根据培养物的种类，外植体的来源及以具体的实验目的和要求来确定的。下列经验可作为枸杞叶片培养实验的参考和依据。1.MS培养基附加2，4-D0.5mg/L,用于诱导胚性愈伤组织，借以观察体细胞胚的形成和发生。2.MS培养基附加6-BA0.1mg/L、NAA0.5ml/L，诱导叶外植体通过体细胞胚发生途径直接形成幼苗。3.MS培养基附加6-BA0.5mg/L、NAA0.5ml/L，诱导叶外植体通过器官发生途径直接形成不定芽。三种培养基中附加蔗糖浓度均为3%。(三)培养基的灭菌把装好的培养基的三角瓶放入高压灭菌锅中，盖好锅盖，关闭放气阀和安全阀，接通电源，进行加温，当锅内压力达到3×104Pa（5磅）时打开放气阀，放气5min，使锅内冷空气完全排出。关上放气阀，等气压升到9.9×104Pa（15磅）时，在9.9×104Pa～1.3×105Pa（15-20磅）下高压灭菌15-20min。断开电源，等高压灭菌锅灭菌后打开放气阀，使锅内蒸气完全放出，打开锅盖，取出培养瓶，置培养室凝固备用。二、取材、消毒与接种(一)取材与消毒自大田中选取无病、无虫、生长正常的枸杞枝条，带回实验室后用自来水冲洗干净，剪下叶子，投入30ml带塞磨口三角瓶中。打开超净工作台，在超净工作台内向瓶内加入少量70%酒精，轻轻摇动15-30s，倒出酒精，加入0.1%升汞液。浸泡消毒8min。倒去升汞液，用无菌水换洗3-4次，彻底清除残留叶面和瓶内的升汞液。（二）接种先用肥皂洗手，穿上工作服，戴上口罩和工作帽，再用新洁尔灭浸泡过的沙布擦抹工作台台面。放入培养瓶和接种用具（接种用的镊子、解剖刀、接种针及培养皿等须事前放入铝饭盒，经150-160℃烘箱热灭菌2-3h），点燃酒精灯，用酒精棉球擦试手臂。把镊子、解剖刀，接种针插入内盛70%酒精的广口瓶中。用镊子把叶子夹入培养皿内的吸水纸上，吸干水珠，把叶子切成3×5mm的大的小片，打开三角瓶，把叶片投入瓶内，用接种针拨匀，重新盖上锡箔纸，扎上橡皮筋，用玻璃铅笔在瓶壁上写明培养材料、培养基代号，标明接种日期。全部接种工作都是在严格无菌条件下进行的，所以要特别认真、仔细、以防杂菌污染。三、培养与观察接种完毕后取出培养瓶，置26-28℃恒温培养室内，照光条件下培养，定期进行观察。培养3-4周时可以看到下列情况：1.MS培养基附加2，4-D0.5mg/L沿切片切口已长出大量色白、疏松呈现颗粒状的愈伤组织。取愈伤组织数块，置实体显微镜下进行解剖，可发现愈伤组织内含有大量处于不同发育阶段的体细胞胚，如球形胚、心形胚、鱼雷胚及大单子叶胚等。大量的研究认为：体细胞胚来源于愈伤组织的单个胚性细胞，属于单细胞起源，因此具有重大的研究价值和应用前景。2.MS培养基附加6-BA0.1mol/L和NAA0.5mg/L愈伤组织为黄绿色，其上已分化出许多小苗，具有两片小子叶，类似于典型的子苗。显微切片观察证明，这些小苗来源于愈伤组织中的单个胚性细胞，是通过细胞胚发生途径形成的。3.MS培养基附加6-BA0.5mg/L和NAA0.5mg/L愈伤组织颜色较绿，质地较为致密，已分化出许多丛生的不定芽，形态特征与2中的情况明显不同，这是通过器官发生途径形成的。作业1.根据枸杞片培养过程中所看到的结果，你认为2,4-D、6-BA和NAA对于形态发生过程各有何种影响？2.人工条件下培养的植物离体器官、组织或细胞、经过分裂、增殖、分化、发育、最终长成完整植株的过程，能够说明什么问题？