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第九章植物细胞、组织及器官的超低温保存植物种质资源是植物育种的基础，种质资源的保存方式有原生境保存和非原生境保存，非原生境保存包括移地保存（种质圃或植物园保存）、种质（种子）库保存、离体保存等。其中种质资源的离体自20世纪60年代逐渐得到广泛应用。种质资源的离体保存是对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质体等材料，采用限制生长、延缓或停止其生长的处理使之保存，在需要时可以重新恢复其生长，并再生植株的方法。离体保存又分为限制生长保存和超低温保存。限制生长保存是利用限制离体培养物的生长速度来保存种质的方法，是离体保存的常用方法。限制离体培养物生长速度的方法主要有：（1）低温保存法（2）高渗透压保存法（3）生长抑制剂保存法（4）降低氧分压保存法（5）干燥保存法而超低温保存是将要保存的材料经过适当处理后，保存在液氮中（-196℃），植物细胞生长停止，但细胞活力和形态发生潜能得到了保存。1949年Polge发现甘油具有保存特性，标志着低温生物学的形成；1980年开始进行玻璃化保存，开展超低温保存研究。动物细胞、组织、胚胎---植物细胞、组织、器官一、超低温种质保存的发展历史：1.保持细胞培养物的遗传稳定性；2.长期保存植物的种质资源;3.长期保存农作物的优良品种及其育种亲本材料的种质；4.建立长期保存的茎尖分生组织种质库及无病毒的原种；5.保存实验材料，防止再培养中遗传变异。二、超低温保存的作用及意义在低于-700C的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。因此采取适当的方法将生物材料降至超低温，即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡。当以适当的方法将冻存的生物材料恢复至常温时，其内部的生化反应可恢复正常。三、超低温保存的原理及理论依据所谓冷冻保存，就是将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度（一般是低于-700C的超低温条件），并在此温度下对其长期保存的过程。而复苏就是以一定的复温速率将冻存的体外培养物或生物活性材料恢复到常温的过程。不论是微生物、动物细胞、植物细胞还是体外培养的器官都可以进行冻存，并在适当条件下复苏。水在低于零度的条件下会结冰。如果将细胞悬浮在纯水中，随着温度的降低，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶损伤。如果将细胞悬浮在溶液中，随着温度的降低，细胞外部的水分会首先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质分子会受到损坏，细胞便发生渗漏，在复温时，大量水分会因此进入细胞内，造成细胞死亡。这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质损伤或称溶液损伤。当温度进一步下降，细胞内外都结冰，产生冰晶损伤。但是如果在溶液中加入冷冻保护剂，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为冷冻保护剂容易同溶液中的水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质损伤，细胞得以在超低温条件下保存。在复苏时，一般以很快的速度升温，1-2分钟内即恢复到常温，细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会暴露在高浓度的电解质溶液中过长的时间，从而无冰晶损伤和溶质损伤产生，冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的结构和功能。冷冻保护剂对细胞的冷冻保护效果还与冷冻速率、冷冻温度和复温速率有关。而且不同的冷冻保护剂其冷冻保护效果也不一样。1.主要仪器设备(1)用于组织和细胞培养的全套设备；(2)普通电冰箱；(3)-70℃--80℃的低温冰箱；(4)程序降温器；四、超低温保存的基本设备和程序(5)玻璃或塑料试管（5ml或10m1），封盖严密，不进液氮；(6)液氮;(7)光学显微镜和紫外荧光显微镜；(8)分光光度计。2.基本程序(1)材料的准备与选择。(2)预处理。(3)将材料装入试管，并随即插入冰浴中。(4)加入0℃预冷的冰保护剂，在0℃(冰浴中)放置30一45分钟。(5)降温冰冻。(6)保存后的化冻：一般在37—40℃温水浴中快速化冻。(7)活力测定,通常采用TTC法(氯化三苯四氮唑还原法)。如果是单细胞或原生质体，可采用活性荧光素染色法，显示活细胞，统计存活率。(8)再培养，观察组织细胞恢复生长的速度、存活率、植株的再生能力。(9)遗传性状的分析：如植株的形态特征、生长发育状况、染色体、同工酶及抗逆性等。1．材料的特性；基因型、抗冻性、器官组织和细胞年龄、生理状态。2．预处理目的：A.增加细胞分裂和同步化；B.减少细胞内自由水的含量；C.增强细胞的抗寒性。五、影响超低温保存效果的主要因素预处理方法：(1)细胞、组织继代培养中．细胞分裂分化同步化的调控，增加指数生长期细胞。(2)预培养，增加培养基中的糖浓度，提高渗透压；或在预培养基中加入诱导抗寒力的物质或冰冻保护剂，如脱落酸(ABA)，山梨糖醇、脯氨酸及二甲基亚砜(DMSO)等。(3)低温锻炼：如香石竹茎尖经4℃低温预处理14天，不仅提高了存活率．而且分化率从30％增加到60％。3．冰冻保护剂迄今，已经报道了多种类型的冰冻保护剂。常用的是二甲基亚砜(DMSO)、甘油、糖和糖醇类物质、氨基酸、多肽及聚乙二醇等。但作为冰冻保护剂的物质应该具备以下特性：（1）易溶于水；（2）在适当浓度下对细胞无毒；（3）化冻后容易从组织细胞中去除。冷冻保护剂的作用：(1)降低冰点，促进过冷却和“玻璃态化”的形成；(2)提高溶液的粘滞性，阻止冰晶的生长，(3)DMSO可使膜物质分子重新分布，增加细胞膜的透性，在温度降低时，加速细胞内的水流到细胞外结冰，防止细胞内结冰的伤害；(4)稳定细胞内的大分子结构，特别是膜结构，阻止低温伤害，非透性保护剂的主要作用在质膜上。4．降温冰冻方法(1)快速冰冻法：将材料从0℃，或者其他预处理温度(如木本植物的冬芽在-3℃一-10℃预处理20天)直接投入液氮。其降温速度在每分钟l000℃以上。植物体内的水分在降温冰冻过程中，从-10℃到-140℃是冰晶形成和增长的危险温度区，在-140℃以下，冰晶不再增生。因此，快速冰冻法成功的关键在于，利用超速冷冻，使细胞内的水分迅速通过冰晶生长的危险温度区，即细胞内的水分还未来得及形成冰晶中心，就降到了-196℃的安全温度，从而避免了细胞内结冰的危险。(2)慢速冰冻法：通常成熟的植物细胞都具有大的液泡，含有大量水分。对大多数植物材料说来，不适宜采用快速冰冻法，而需要在冰冻保护剂存在的条件下，采用慢速冰冻法。以每分钟0.1-10℃的降温速度(一般1—2℃／分较好)。降到—70℃左右，随即浸入液氮，或者以此种速度连续降到一196℃。在这种降温速度下，可以使细胞内的水分有充足的时间不断流到细胞外结冰，从而使细胞内的水分减少到最低限度，达到良好的脱水效应，避免细胞内结冰。(3)两步冰冻法：这种方法是慢冻法和快冻法的结合，或者说，是一种改良的慢冻法。第一步是用慢速降温法从0℃降到一定的预冻温度，使细胞达到适当的保护性脱水；第二步，投入液氮中迅速冰冻。(4)逐级冰冻法：此方法是制备不同等级温度的冰浴，如—10℃，—15℃，—23℃，—35℃，或—40℃等。保存材料经冰冻保护剂在0℃预处理后，逐步通过这些温度，样品在每级温度上停留一定时间(4—6分钟)，然后浸入液氮。5．化冻方法实验证据证实，植物的冻害常发生在冰凉和化冻两个过程。因此要使植物种质的超低温保存获得成功，不仅要求有一个合适的降温冰冻程序，而且还要求采取合适的化冻方法，以避免在化冻过程中产生细胞内的次生结冰，并应防止在化冻吸水过程中水的渗透冲击对细胞膜体系的破坏。通常采用快速化冻方法，即将液氮保存后的材料在37—40℃的温水浴中化冻。因为超低温冰冻材料化冻时，再次结冰的危险温度区域大约是—50℃至—10℃。从理论上说，借助迅速的化冻速度通过此温度区，从而避免细胞内次生结冰。6．光照对恢复生长的影响黑暗条件下有利于超低温保存培养物的恢复生长。1.显示细跑活力的TTC法(氯化三苯四氮唑还原法)，反映脱氢酶活力。2．显示细胞存活率的二醋酸酯荧光素(FDA)染色法，反映酯酶的脱脂化作用，或采用中性红染色法。3.再培养新鲜培养基上培养。存在停滞期。六、超低温保存后细胞活力、存活率及遗传特性的观测4.遗传性状的分析：1)细胞全能性的保持：形态发生能力的表达情况。2)后代的形态特征及生长发育状况。3)后代染色体的分析。4)同工酶谱的分析。5)特殊产物的分析。6)抗逆性的分析。1.已进行超低温保存的植物：目前已超过30种植物成功进行了愈伤组织及悬浮细胞超低温保存。保存后的材料表现出较高的存活率。七、愈伤组织及悬浮培养细胞的超低温保存2．组织和细胞超低温保存实验程序(1)将培养5一7天的悬浮培养细胞，或培养10一15天的愈伤组织收集于保存试管中，每管0.5-1.0ml。(2)将盛有材料的试管插入冰浴中，待温度平衡后，加入0℃预冷的冰冻保护剂(10％DMSO+0.5mo1／L山梨糖醇)，使保护剂稍淹过保存材料。在0℃放置30分钟。(3)以1℃／分的降温速度从0℃降到-10℃，轻轻摇动试管，使试管内的溶液结冰。停留15－20分钟。然后以同样降温进度降到-30℃－-40℃，停留2小时，然后浸入液氮中。(4)在液氮中贮存一定时期后，取出材料在37—40℃温水浴迅速化冻，化冻后立即转移到20℃水浴中。(5)化冻后，用含3％蔗糖的液体培养基洗涤3次，为减轻和避免渗透冲击的伤害，培养液应逐步加入。(6)洗涤后立即转移到新鲜培养基上进行再培养：或者不经洗涤，直接转移到半固体培养基上，或漂浮于液体培养基的滤纸上培养。先置于黑暗条件下培养15—30天，然后转移到光照下培养。(7)待恢复生长后，统计存活率。此外，在化冻洗涤后，可采TTC法和FDA荧光染色法观测细胞的活力和存活率。(8)当愈伤组织长到良好状态时，转移到分化培养基上，检验形态发生能力的保持情况。(9)植株形态特征、生长发育及遗传性状的观察和分析．1、茎尖超低温保存植物种类：八、芽及茎尖分生组织的超低温保存2.茎尖分生组织的超低温保存程序：（1）种子消毒灭菌，种子经70％酒精迅速漂洗，10％漂白粉溶液消毒20分钟，无菌水洗涤4次．(2)在无菌条件下播种于具润湿滤纸的灭菌培养瓶或培养皿内。置于25—28℃培养箱中黑暗培养。(3)萌发生长4—5天后，在无菌条件下切取茎尖的分生组织，0.3一0.5mm长，第1对叶原基。在实体解副镜下进行操作。(4)将切取的茎尖分生组织接种于固体B5培养基上，内含0.5pmol／LBA及5%DMSO，光照16小时，温度20℃／15℃预培养48小时。(5)预培养后，将培养瓶浸入冰浴中2小时。(6)将茎尖分生组织转移到在冰浴中预冷的具有1m1液体B5培养基的离心管中。(7)逐步加入等体积的预冷的10％DMSO，在30分钟内加完，使DMSO的最终浓度为5%，然后再放置10一30分钟．(8)密封离心管口，以每分钟降低0.6℃的速度慢速降温到—40℃，然后浸入液氮中(—196℃)。(9)在液氮中贮存—定时期后，取出材料在27℃水浴中迅速化冻。化冻后．立即将试管转移到冰浴中．(10)用等体积B5培养基在30分钟内，分6次逐步加入试管中。(11)吸去混合液，并用B5培养基洗涤4次。然后将茎尖分生组织转移到固体B5分化培养基上。3周后可分化成苗。植株的再生率达70％以上，已有的试验表明，贮存2年多仍能存活。Sakai(1990)和Yamada(1991)建立了一种茎尖分生组织的超低温保存简便方法，该技术的关键是，在冰冻前，用高浓度的冰冻保护剂使保存材料脱水，以致不需要慢速程序降温，从室温直接浸入液氯，即可获得很高的存活率。保存程序：(1)从试管苗中切取茎尖分生组织。(2)在含1．2mo1／L山梨糖醇的B5培养基上4℃预培养2天。(3)将预培养后分生组织放入试管，然后加入高浓度的冰冻保护剂。在含0。4mo1／L蔗糖的B5培养基中溶解30％(w／v)甘油，35％(W／v)乙二醇和15％(w／V)