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第七章细胞培养植物细胞培养（plantcellculture）是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养使其增殖的技术根据培养规模:小规模培养和大批量培养；根据培养方式:悬浮培养、单细胞培养等；根据要求产物:用于诱变的细胞培养和生产次生产物的细胞培养。§1.单细胞分离§2.悬浮培养§3.单细胞培养技术§4.植物细胞大规模培养与次生产物生产§1.单细胞分离由完整的植物器官分离单细胞由培养组织中分离单细胞1、由完整的植物器官分离单细胞叶片是分离单细胞的最好材料机械法酶解法撕去下表皮露出叶肉细胞用解剖刀刮下细胞1-1、机械法第一种方法：用刀片刮叶片第二种方法：叶片研碎、离心研碎成粉加研磨介质过滤、离心只有薄壁组织排列松散，细胞间接触点很少时用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。1-2、酶解法Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞加果胶酶过滤、离心2、由培养组织分离单细胞茎段步骤摇床用于振荡继代悬浮(3)（Suspensionculture)将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物15mlmedium/1g120rpmcultureTransfer1time/3d3weeks100-130目网过滤Centrifuge(离心）isolation注意：选择适宜的外植体：幼胚、胚轴、子叶是最常使用的外植体。选择适宜的培养基：较高浓度激素浓度，特别是生长素，必要的附加物质，例如水解酪蛋白、Pro、Gln。继代多次，以获得均匀一致疏松的愈伤组织。§2.细胞悬浮培养(cellsuspensionculture)一、细胞悬浮培养的概念和意义悬浮培养是将单个游离细胞或小细胞团悬浮在液体培养基中进行培养增殖的技术。BioreactorforcontinuouscellsuspensionsShakerforsuspensioncultureCulturewheel1、细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；2、能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。CellsuspensionPlantsArtificialseedsSecondaryproductsIsolationprotoplastsMutationselect细胞悬浮培养的应用三.细胞悬浮培养的方法1、培养基对于用愈伤组织制备的悬浮细胞培养的培养基以原愈伤组织继代时的培养基除去琼脂为好。为了提高细胞的分散度，对于生长素和细胞分裂素的比例需要进行一些调节。2、培养细胞的起始密度及细胞记数（1）最低有效密度的概念在悬浮细胞培养中，使悬浮培养细胞能够增殖的最少接种量称为最低有效密度或者临界的起始密度。最低有效密度由于培养材料、原种培养条件，原种保存时间长短、培养基的成分不同而有差异，一般为104~105细胞/ml（2）细胞记数要保证细胞培养的最低有效密度，在细胞游离后要对分离的单细胞进行记数，可用血球记数板。（3）活细胞测定除测定细胞密度外，尚需要测定活细胞率以作为测定起始密度的参考活细胞率（%）=（5个视野中的活细胞数/5个视野中的细胞总数）×100%活细胞测定的方法；A、醋酸酯荧光素（FDA）染色法FDA本身无荧光，无极性，可自由通过原生质体膜进入细胞内部，进入后由于受到活细胞内脂酶分解，而产生有荧光的极性物质荧光素，不能自由出入原生质体膜，在荧光显微镜下观察到的荧光是有活力的，反之无活力。具体操作：取0.5ml细胞悬浮液放入到小试管中，加入FDA溶液，使最后浓度达到0.01%，混匀，室温下作用5min，荧光显微镜观察。B、酚藏红花染色法先配制0.1%酚藏红花溶液，溶剂为培养液。检查时将悬浮细胞取一滴放在载玻片上，滴一滴0.1%酚藏红花，盖上盖玻片，染成红色的是死细胞，无色的是活细胞。3、悬浮培养细胞数目的增殖变化细胞生长各个时期的特点：滞后期（延迟期）:细胞很少分裂，其长短与接种量大小和继代时原种细胞所处的生长期有关对数生长期:细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长速率保持不变直线生长期:细胞生长和发育最明显的时期缓慢期:生长逐渐缓慢,培养液消耗将尽，有毒代谢物质增多，氧气减少静止期:生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚至开始死亡。讨论:A、滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。B、加入条件培养基可以缩短滞后期。条件培养基：曾培养过一段时间组织或细胞的培养基。C、缩短两次继代时间间隔，则可使悬浮培养的细胞一直保持对数生长期。D、如果使处在静止期的细胞悬浮液保持时间太长，则会引起细胞的大量死亡和解体。操作注意事项：对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径要小，只能通过单细胞或小细胞团（2-4细胞），使用吸管或注射器。继代前，培养容器静置短时间，大细胞团沉降，再吸上层悬浮液。依此，多次，可建立良好的细胞悬浮培养物。4、细胞生长的测定对于任何一个建立的细胞悬浮系都应该进行动态的测定，以掌握其生长的基本规律，为继代培养或其他研究提供依据。A、细胞记数注意：由于悬浮培养的细胞并不会呈游离单细胞，因此通过培养瓶中直接取样很难进行可靠的细胞记数。可用5%~8%铬酸或0.25%的果胶酶对细胞团进行处理生长速率pP=（lnx-lnX0）/tX为t时间的细胞密度，X0为起始细胞密度B、细胞大小的测定技术（用显微测微计）C、细胞体积：将一定量的细胞悬浮液放入放入15ml刻度离心管中于2000g离心5min。以每毫升培养液中细胞体积的毫升数来表示。D、细胞的干重和鲜重：将一定量的细胞悬浮液加到预先称重的尼龙布上，用水冲洗并抽滤除去细胞粘着的多余水滴，然后称重，两者差就是细胞的鲜重。干重一般是将离心收集的细胞转移到预先称重的滤纸片上，然后在60℃烘12h，在干燥器中冷却后称重。细胞的干重和鲜重一般以每毫升悬浮培养物的重量表示。E、有丝分裂指数在一个细胞群体中，处于有丝分裂的细胞占总细胞的百分数称为有丝分裂指数，指数越高，分裂进行的速度越快。一般用孚尔根染色法，先将组织用1molHCl在60℃水解后染色，常规镜检，统计500个细胞，计算。5、一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚至更短时间便可增加一倍。6、影响悬浮细胞生长的因素：起始愈伤组织的质量：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。接种细胞密度：接种初期的细胞密度过低往往使延迟期加长，悬浮细胞的起始密度一般在0.5～2.5×105个细胞/毫升，低于这一密度则会使细胞生长延迟。培养条件：方式、温度、继代周期四、悬浮细胞的同步化细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。同一培养体系中，细胞不同步使悬浮细胞的分裂、代谢以及生理、生化状态等更趋复杂化，所以人们一直希望通过一定的技术途径，使同一培养体系中的细胞能保持相对一致的细胞学和生理学状态，工作中常用的处理方法：1、物理方法1）分选法通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。悬浮液47μm膜过滤滤液31μm膜过滤收集加入到10%~18%的Ficoll加入等体积的培养基网上细胞180g离心5min收集各细胞层的细胞用培养基洗涤分别接种2）冷处理法：低温处理可以提高培养体系中细胞同步化的程度2、化学方法1）饥饿法悬浮培养细胞中，若断绝供应一种细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1或G2期，经过一段时间的饥饿之后，当在培养基中重新加入这种限制因子时，静止细胞就会同步进入分裂。2）抑制剂法通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞停留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期的细胞。常用的抑制剂有5-氟脱氧尿苷，5-氨基尿嘧啶、羟基尿等。3）有丝分裂阻抑用秋水仙素处理指数生长的悬浮培养物，浓度一般控制在0.2%，处理时间以4-6小时为宜•无论何种细胞同步化处理，对细胞本身或多或少都有一定的伤害。如果处理的细胞没有足够的生活力，不仅不能获得理想的同步化效果，还可能造成细胞的大量死亡，因此在进行同步化处理之前，细胞必须进行充分的活化培养。用于处理的细胞系最好处于对数生长期。§3.单细胞培养技术一、植物单细胞培养的意义1、建立单细胞无性系悬浮培养细胞间细胞间在遗传、生理和生化上存在差异，这些差异反映在它们的产量、品质、抗病虫性和抗逆性等方面。如果能将高抗、高产、高品质的细胞株筛选出来，无疑会带来巨大的经济效益。2、排除体细胞的干扰3、利于对细胞活动跟踪观察二、单细胞培养的方法1、细胞平板培养概念：将制备好的单细胞悬浮液，按照一定的细胞密度，接种在1mm左右的薄层固体培养基上进行培养，称之为平板培养主要技术要点：单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不能超过6个细胞，因此过滤时网筛的网眼要选择合适。单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤2次以后，调整密度为5×105/ml植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀的平铺与培养皿中，其厚度为1-2mm。待植板后的培养基完全凝固后，用石蜡或parafilm封口膜将培养皿封严以防污染在25℃黑暗条件下培养3周即可长出肉眼可见的愈伤组织。植板率评估：它以能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例来表示。植板率(％)＝(形成的细胞团数/接种的细胞数)×100％计算式中每个平板新形成的细胞团数的计数方法有两种：一是直接计数法，注意计量时要掌握合适的时间，即细胞团肉眼已能分辨，但尚未长合到一起的时候。二是感光法，在暗室的红光下将一印相纸放于欲计数的培养皿下，其上放一光源使培养皿中细胞团印到相纸上，冲洗照片计数。2、看护培养概念：用一块愈伤组织或植物离体组织看护单细胞使其生长增殖的一种单细胞培养方法。3、微室培养概念：人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法，称微室培养。特点：（1）能在显微镜下追踪单细胞分裂增殖形成细胞团的全过程（2）培养基少，营养和水分难以保持，pH值变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。4、其它单细胞培养技术A饲养层培养基技术将饲养细胞先用射线辐射处理，然后将饲养细胞和培养细胞混合植板，经过照射的细胞对于培养细胞起到一个饲养作用。B双层滤纸植板培养方法培养基饲养层细胞看护滤纸层转移碟滤纸培养细胞§4.植物细胞大规模培养与次生代谢产物生产一.概述二.培养系统三.植物细胞规模培养技术要点四.提高细胞次生代谢产物的途径五.细胞规模化培养中的有关技术问题一、概述•植物次生代谢产物是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢。所以把这一技术认为是植物细胞的“发酵工程”。•A、有特殊的类似发酵工业反应器的生产系统和回收工艺。•B、与植物的栽培不同，而与发酵工业相似，是独立众多的外界环境因素（包括天气、地理、季节、寄生物等）的生产过程。•C、有较稳定的产品的质量和数量，可节省耕地，也可看作是一个“农作物”的储存库。1.植物产生代谢产物的类型•植物次生产物种类繁多（据保守估计已超过2万种），根据分子结构不同大致分为：•酚类化合物－黄酮类•单酚类•醌类（苯醌、萘醌、蒽醌）•萜类化合物－三萜皂甙•甾体皂甙•单萜、倍半萜、二萜•含氮化合物－生物碱（真生物碱、伪生物碱、原生物碱）•胺类（伯、仲、叔、季胺）•非蛋白质氨基酸•多炔类、有机酸等2．植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义。李时珍（1593）在《本草纲目》中所开列的1892种药物绝大多数是植物药物，目前仍有约25％的法定药品来自植物。