植物组织培养的一些注意事项(1)

1植物组织培养的一些注意事项一、常用培养基主要特性1、高盐成分培养基包括MS、LS、BL、BM、ER等培养基。其中MS培养基应用最广泛,其钾盐、铵盐及硝酸盐含量均较高,微量元素种类齐全,其养分数量及比例均比较合适,广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生质体的培养。LS、BM、ER培养基由MS培养基演变而来。2、硝酸钾含量较高的培养基包括B5、N6、LH、GS等培养基。①B5培养基B5培养基除含有较高的钾盐外,还含有较低的铵态氮和较高的盐酸硫胺素,较适合南洋杉、葡萄及豆科与十字花科植物等的培养。②N6培养基N6培养基(朱至清等1975)系我国学者创造,获国家发明二等奖,适用于单子叶植物花药培养,柑橘花药培养也适合,在楸树、针叶树等的组织培养中使用效果也好。③SH培养基是矿盐浓度较高的一种培养基,其中铵与磷酸是由磷酸二氢铵(NH4H2PO4)提供的,这种培养基适合于某些单子叶及双子叶植物的培养。3、中等无机盐含量的培养基①H培养基本培养基大量元素约为MS培养基的一半,仅磷酸二氢钾及氯化钙稍低,微量元素种类减少,而含量较MS为高,维生素种类比MS多。适于花药培养。②尼奇培养基(Niotsch1969)此培养基与H培养基成分基本相同,仅生物素比H培养基高10倍。也适合于花药培养。③米勒培养基(Miller1963)此培养基和Blaydes(1966)培养基二者成分完全相同。适合大豆愈伤组织培养和花药等培养用。4、低无机盐培养基大多情况下用于生根培养基。有以下几种:①改良怀特培养基(White1963)②WS培养基(Wolter&Skoog1966)③克诺普液(Knop1965)花卉培养上用得多。④贝尔什劳特液(Berthelot1934)⑤HB培养基(Holley&Baker1963)此培养基在花卉脱毒培养和木本植物的茎2尖培养中效果良好。其成分是大量元素比1/2克诺普(Knop)液稍多,微量元素用贝尔什劳特液,每升培养基中加0.5ml。二、与培养基有关的一些细节问题1、培养基所用药品应采用等级较高的化学纯CP(三级)及分极纯AR(二级),以免杂质对培养物造成不利影响。2、调节PH也可用精密pH试纸(应在干燥器中保存,以免吸湿而失效)。培养基过酸的可用1mol/L氢氧化钠(NaOH)来调节;培养基过碱的可用1mol/L盐酸(HCl)来调节(1mol/LNaOH的配制方法是称40gNaOH,溶解后加入蒸馏水,定容到1000ml即可。1mol/LHCl的配制方法是量取12mol/LHCl84ml,加水定容至1000ml)。经高压蒸汽灭菌后,由于某些成分的分解(如蔗糖的分解)或氧化,酸度会增加(pH值一般可降低0.2)。有时玻璃器皿质量较差,其中一部分物质溶解,也会影响酸度的变化。这些在调整pH值时都要考虑进去。分装后应立即灭菌,若因故不能及时灭菌,最好放入冰箱中在24h内完成灭菌工作。灭菌时压力表读数为0.8kg/cm2～1.1kg/cm2,121℃时保持15min～20min即可。3、某些生长调节物质,如吲哚乙酸、玉米素及某些维生素等物质遇热不稳定,因此不能进行高压灭菌,而需用过滤方法灭菌,经过滤灭菌的溶液,可在琼脂培养基温度下降到大约40℃时加入到已高压灭菌的培养基中。4、配好的培养基可放到培养室中预培养3d,若没有污染反应,则证明是可靠的,可以使用。暂时不用的培养基最好置于10℃下保存,含有生长调节物质的培养基在4℃～5℃低温下保存则更理想。含吲哚乙酸或赤霉素的培养基应在配制一周内用完,其他培养基至多也不能超过一个月。一般情况下,两周内应用完,以免干燥变质。三、培养材料及消毒1、取材季节的影响：大多数植物应在其生长开始的季节采样,生长末期或已进入休眠期,则外植体对诱导反应迟钝或无反应。2、器官的生理状态和发育年龄：沿植物的主轴,越向上的部分所形成的器官其3生长的时间越短,其生理年龄也越老,越接近发育上的成熟,越易形成花器官。反之,越向下,其生理年龄越小。木本植物的组织培养中,以幼龄树的春梢嫩枝段或基部的萌条较好,下胚轴与具有3对～4对真叶的嫩茎段,生长效果也较好。一般情况下,幼年组织比老年组织具有较高的形态发生能力。3、材料大小的影响：材料越小成活率越低,茎尖培养存活的临界大小应为一个茎尖分生组织带1个～2个叶原基,约0.2mm～0.3mm大小。叶片、花瓣等约为5mm2,茎段则长约0.5mm。因此,除非用于去除病毒否则不宜将外植体切的过小。但并不是说外植体越大越好,外植体过大易造成污染,有实验证明外植体越大污染率越高。4、材料的灭菌：一般是组织越大越易污染,夏季比冬季带菌多，甚至不同年份污染的情况也有区别。取材最好选在中午或下午,避开阴雨天取材可减少污染率。消毒是为了消灭病菌,以保证无菌组织培养的进行。但不同植物及一株植物不同部位的组织,其带菌程度不同,它们对不同种类、不同浓度的消毒剂的敏感度也不一样。最初所使用的消毒剂种类,浓度及消毒时间的长短都要进行摸索,以达到最佳的消毒效果。材料有绒毛最好在消毒液中加入几滴吐温-80,对与难消毒的根及地下部位材料可将其浸入消毒液中进行抽气减压,以帮助消毒液的渗入,从而达到彻底灭菌的目的。潘学峰等(1998)报道,12%的双氧水+0.1%的升汞混合液对南方地下茎生姜灭菌10min的效果最好。四、材料的接种1、接种室的消毒：植物组织培养技术实际上是一种无菌操作和无菌培养技术,做好接种室的消毒是至关重要的。污染的主要来源是空气中的细菌和真菌孢子,因此,每次接种前应进行地面的清洁卫生工作,并用70%酒精喷雾使空气的灰尘沉降,并用紫外线灯照射20min。接种前超净工作台面要用新洁尔灭或酒精擦洗,并定期清洗过滤膜,以延长使用寿命。2、无菌操作要求：工作人员使用的工作服、帽子、口罩等,要经常保持干净,并定期进行消毒,即将洗净、晾干的衣帽、口罩等用纸包好后与培养基一起进行高压灭菌。工作人员的头发、衣服、手指中都带有许多杂菌,为此要穿上工作服,戴4上帽子,也必须剪除指甲,并用肥皂擦洗,最好再在新洁尔灭溶液中浸泡10min,接种操作前则用70%酒精擦洗。工作人员的呼吸所产生的污染,主要是在接种时谈话或咳嗽所引起的,因此,在操作时应禁止谈话并应戴上口罩。3、材料的分离、切取和接种切割动作要快,防止挤压使材料受损伤而招致培养失败,也要避免使用生锈的刀片,以防止氧化现象产生。接种时要防止交叉污染的发生,刀和镊子等接种工具使用一次应放入70%(或95%)酒精中浸泡,然后灼烧放凉备用。接种时轻轻取下封口纸,动作要慢以免气流冲入瓶中造成污染。将瓶口靠近酒精灯火焰,瓶口倾斜,以免空气中的微生物落入瓶中,将瓶口外部在灯焰上燎数秒钟,将灰尘杂物等固定在原处,然后用镊子将外植体送入瓶中,材料在培养容器内的分布要均匀,以保证必要的营养面积和光照条件。茎尖、茎段等基部插入固体培养基中,叶片通常将叶背接触培养基,这是由于叶背气孔多,利于吸收水分和养分的缘故。五、材料的初代培养1、实验方案的设计1）、单因子实验设计：单因子实验是组织培养中最常用的实验方法,尤其在选择适当的激素种类和浓度配比上使用最多。2）、正交实验设计植物离体培养的成功是由多种因素决定的。正交设计是多因素分析的有力工具,它可以很方便的从众多因素中选出主要影响因素及最佳水平,因为它可以用较少的实验次数得到较多的信息。例如,一个7因素水平的实验,若将各因素水平全部组合都做一遍,需要27=128次,而正交设计只需做8次实验就可以了,虽然实验次数减少了,但因为各因素水平搭配均匀,8次实验基本代表了全部实验的情况。正交实验的设计,主要工具是正交表。大多数生物统计学书都列出了可供选择的正交表,如L4(23),L8(27)见(表2-11,表2-12)。字母L右下角号码8表示它有8个实验要做,括号内的指数7表示这张表所安排的实验最多可考察7个因素(也可安排2个～6个,超过7个要选择其他正交表),底数2表示被考察的因素只要求两个水平。在进行实验前可根据要测试因素的多少及每种因素所5考察的水平,选择适合的正交表,然后按表进行实验。现举一个例子来说明,设影响某种植物试管苗生长的因素有光照时间、光照强度、pH值、温度、蔗糖浓度、BA浓度、NAA浓度7个因素,每个因素选择两个水平,即,光照时间(10h,14h)、光照强度(1000lx,2000lx)、pH值(5.5,5.8)、温度(20℃,25℃)、BA浓度(0.5,2.0)、NAA浓度(0.5,1.0)、蔗糖浓度(2%,4%)。现根据因素和水平的多少选择一个适合本实验的正交表,选L8(27)最理想,填表时,因素水平对号入座,见表(2-13)。第一号实验是光照时间10h/d、光照强度1000lx、pH值5.5、BA浓度2.0、NAA浓度0.5、蔗糖浓度4%,其他实验依次类推。根据8个实验结果,如出苗数量、苗高、生根数、移栽成活率等,综合考虑,根据需要选取各最适培养条件。也可通过一定的计算方法(参考统计学书),算出极差(R),极差(R)表示每个因素在实验中所起作用的大小,R越大表示该因素的不同水平对实验结果的影响越大,但若没有可计算的指标时,还是选择单因子实验较好。62、初代培养物的建立1）、保证无菌2）、条件合适：首先,一定要选择好合适的作物种类、品种及培养的部位;其次,一定要选择合适的培养基,激素及其他添加物;还要注意掌握适宜的环境条件。所以在进行一种植物的组织培养之前,应查找该种植物有关方面的资料,根据这种植物过去所采用的培养部位、培养基、培养条件和培养技术等,再决定自己的工作步骤。3）、操作技术过关3、污染的防治1）、植物材料的选择及防止污染通常多年生的木本材料比一二年生的草本材料带菌多;老的材料比幼嫩的材料带菌多;田间生长的材料比温室生长的材料带菌多;带泥土的材料比不带泥土的材料带菌多。为此对于培养材料的取材就应很认真地加以选择,以减少污染的发生。用茎尖作外植体时,应在室内或无菌条件下对枝条进行预培养。将枝条用水冲洗干净后插入无糖的营养液或自来水中,使其发枝,然后以这种新抽的嫩枝条作为外植体,便可大大减少材料的污染。或在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养,待抽出徒长的黄化枝条时取材,也可明显地减少污染。对木本植物等难以消毒的材料可采用多次灭菌法。如将切好的外植体放入1.3%次氯酸盐溶液中(商品漂白粉25%的溶液)消毒30min,然后用无菌水冲洗3次,7再放在无菌条件下,次日用2.6%次氯酸钠灭菌30min,然后用无菌水冲洗3次。也可采用多种药液多次浸泡法,以加强灭菌效果。材料内部易感染病菌,在这种情况下,必须在培养基中加入抗生素类,防止初代培养物污染。2）、人为污染的防止接种前应用肥皂将手仔细洗净后,再用70%酒精擦洗双手,并需及时剪除指甲。在工作中特别要注意避免交叉感染,双手必须清洁,工具则用一次即需消毒一次。工作人员呼吸所产生的污染,主要是接种时说话或咳嗽所引起的,因此,操作时严禁谈话,并应戴上口罩,也应穿工作服,戴工作帽。污染中特别注意一种呈乳白色的细菌污染,这种细胞为芽孢杆菌。法国林木育种协会鉴定为迟缓芽孢杆菌(Bacilluslenlus),它外被荚膜,耐高温,一般消毒剂难以杀死。它可随培养材料、用具等传播;它可出现在培养基表面,或呈滴形云雾状存在于培养基内。若出现应严格灭菌,清洗用具,更换消毒酒精。4、防止外植体褐变1）、褐变的影响因素褐变是由于组织中的多酚氧化酶被激活,使细胞的代谢发生变化,酚类物质被氧化后产生醌类物质,这类物质呈棕褐色,它们会逐渐扩散到培养基中,抑制其他酶的活性,毒害培养的材料。褐变的影响因素是复杂的,随植物种类、基因型、外植体的部位及生理状况等的不同而危害的程度也有区别。材料本身的生理状态不同,接种后褐变的程度也不同。如在欧洲栗的培养中,用8幼年型的材料培养含醌类物质少,而用成年型材料培养时含醌类物质多。而在卡德利亚兰的培养中,较短的新生茎致褐物质含量高,而较长的新生茎致褐物质含量低,另外致褐物质的含量也因季节的不同而不同,冬季褐变少,夏秋季褐变最严重,存活率最低。在枝条上取芽的时期及所取