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第四章胚胎培养及离体授粉目的与要求了解植物胚培养类型、过程、培养条件，以及胚培养的应用。了解植物胚乳培养过程和培养条件，了解胚乳培养在实践中的应用。认识植物胚珠和子房培养方法及其在生产上应用。具备胚胎培养基本认知，有进行各类胚胎培养的基本能力。一、胚胎培养概念胚胎培养是将植物的胚胎与母体分离，培养在已知化学成分的培养基上。二、胚胎培养应用：1、解决育种中实践中遇到的问题；2、研究胚胎发育过程中与胚发育有关的内外因素。三、胚胎培养类型幼胚培养、成熟胚培养、胚乳培养、胚珠培养、子房培养第一节胚培养一、培养类型所谓胚培养就是采用人工方法把胚从种子、子房、胚珠中分离出来，放在无菌条件下让其进一步生长发育、以至形成幼苗的过程。1、离体胚培养时期自养期：能在基本的无机盐和蔗糖培养基上生长。异养期：幼胚由胚乳及周围的组织提供养分。2、离体胚培养类型⑴成熟胚培养（子叶形成以后）⑵幼胚培养（子叶形成之前）二、培养过程1、幼胚培养过程Hanning早在1904年就培养了萝卜和辣根菜的胚，发现离体胚可以充分发育，并且提前萌发形成小苗，这是世界上胚培养最早获得成功的一例。幼胚培养的关键技术：取材时期幼胚剥离培养条件的控制（是否需要特殊处理）成熟或未成熟子房——70%酒精浸数S——0.1%升汞或饱和漂白粉浸10-30min——无菌水冲洗——剖出胚珠——取出完整胚——接种在培养基上。一般采用固体培养法。（同时配制两种培养基）培养条件：20-30℃，2000Lx。10-14h幼胚离体培养的生长发育方式；(1)胚性发育胚只是在体积上增大甚至超过正常胚大小而不能萌发成苗。(2)早熟萌发幼胚不再发育，迅速萌发成幼苗。多数情况一个幼胚萌发成一个植株，有时因细胞分裂形成许多胚状体，进而形成许多植株，即丛生胚现象。(3)愈伤组织多数植物幼胚形成愈伤组织。再分化成胚状体或形成芽苗。2、成熟胚培养过程种子——95%酒精消毒——选取完好种子——70%酒精浸数S——0.1%升汞或10%次氯酸钠浸泡——无菌水冲洗——种子培养几天——剥离种胚——接种在培养基上。培养条件：黑暗培养、25℃三、影响因素（一）培养基1、无机盐成熟胚是含有根原基和茎原基以及一个或两个次生附属子叶。培养时进一步发育产生根和茎，此时在营养上相对独立，只需要提供简单的营养条件，在含有大量元素的无机盐和糖的培养基上即能生长。幼胚则是异样的，要求更复杂的培养基。除了一般的无机盐成分外，还要加入微量元素和生长辅助物质，不同发育时期的幼胚对培养基成份要求不同，胚龄越小培养及成份越复杂。2、糖类幼胚需要蔗糖浓度较高作用：调节培养基渗透压，作为碳源和能源，防止幼胚早熟萌发。成熟胚2%，幼胚8-12%。培养过程中，转移到蔗糖水平低的培养基上。3、氨基酸和维生素加入氨基酸，能刺激胚的生长。加单一氨基酸时，以谷氨酰胺最好。维生素对幼胚是必须的，对已萌发的胚，可能有抑制作用。4、植物生长调节物质成熟胚一般不需要外源激素就可萌发，但加入激素可显著增加培养物的生长，尤其对打破休眠。幼胚培养的关键是使加入的生长调节剂和植物内源激素间保持某中平衡，以维持其胚性生长。5、天然有机物加入一些天然的胚乳或种子提取物，对离体胚生长有促进作用。（二）培养条件1、PH5.2-6.0，水稻5.0,柑橘5.82、温度25-30℃左右3、光照黑暗或弱光4、培养基形态液体适合幼胚培养，固体适合成熟胚培养（三）胚柄胚柄是一个短命的结构，长在原胚的胚根一端，当胚达到球形期，胚柄发育到最大。胚柄可参与幼胚的发育过程。一般胚柄较小，很难与胚一起剥离出来，所以培养的胚都不具备完整的胚柄。在幼胚培养中，胚柄的存在对幼胚的存活是关键。因为胚柄的存在会显著刺激胚的进一步发育，在胚发育的心形期达到高潮。没有胚柄存在时，一定浓度范围的KT可促进幼胚生长，但赤霉素作用更好。四、胚培养的应用1、远缘杂交中应用2、克服珠心胚的干扰，提高育种效率3、缩短育种周期4、测定休眠种子的萌发率5、理论研究中应用胚珠及胚囊的发育第二节胚乳培养胚乳培养—将胚乳从母体上分离出来，在无菌条件下人工培养，使其生长发育成为幼苗的过程。胚乳培养的最早研究始于1933年，Lampe和Mills首例进行了玉米胚乳培养。到目前为止，已有40多种植物的胚乳进行了培养。其中苹果、柚、橙、檀香、枸杞、猕猴桃、玉米、大麦、小黑麦、水稻、马铃薯、梨、核桃等的胚乳培养得到了再生植株。其它有的分化出芽、根、叶等或得到愈伤组织。一、培养过程1、胚乳外植体的制备⑴胚乳较大块组织的种子，可直接将种子表面灭菌，无菌条件下除去种子的外皮即可培养。⑵桑寄生类植物，胚乳被流质层包裹，不好取出胚乳，可先将种子表面灭菌，无菌条件下剥开种皮，去掉粘性流质层，取出胚乳。⑶带果实的的种子（斛寄生类），取授粉几天后的幼果，表面灭菌后，无菌条件下切开幼果，取出种子，小心分离出胚乳，接种在培养基上。培养室温度25-27℃，黑暗或弱光下桑寄生科蔷薇亚纲的一科。半寄生性灌木，稀草本，寄生于木本植物的枝上，少数为寄生于根部的陆生小乔木或灌木。花以造孢细胞发育成的胚囊所代替。主要产于世界热带地区，温带分布较少。中国，大多数分布于华南和西南各省区；有些种类可供药用，如桑寄生、广寄生、槲寄生等。根据花的形态、花粉粒和果的构造不同，分为桑寄生亚科和槲寄生亚科。2．离体胚乳的发育及其植株的形成⑴愈伤组织的诱导胚乳接种后的6-10天后，不断增生成乳白色团状，成为愈伤组织。少数胚乳外植体可转为绿色叶状丛。⑵愈伤组织的再分化生长旺盛的愈伤组织应及时进行分化培养，此时需光。有器官发生和胚胎发生途径。⑶胚乳苗的生根培养转入生根培养基10-15天后即可长根植物胚乳可分为两大类：被子植物胚乳——被子植物中它是双受精的产物，胚乳属于三倍体。裸子植物胚乳——裸子植物很特殊，它的胚乳在受精前就已形成。裸子植物的胚乳为是单倍体。3、适合培养的胚乳的发育时期几种植物胚乳培养的最佳时间(授粉后天数)大麦10～12天黄瓜7～16天小黑麦7～14天4、胚乳植株染色体数目的检查取胚乳培养植株根尖、幼叶或胚乳愈伤组织，0.2-0.5%秋水仙素（或对二氯苯饱和溶液）25℃下处理4-8h，流水冲洗，卡洛氏液或FAA固定，1mol盐酸60℃水溶下水解10min，染色、压片、观察。二、影响因素（一）培养基1、White和MS2、辅助生长物质2,4_D，玉米素等3、天然提取物20%番茄汁、葡萄汁、玉米汁、椰乳、水解酪蛋白、酵母提取物促进胚乳培养4、蔗糖3-5%。小麦8%，枸杞5%二、影响因素（二）培养条件1、ph4.5-6.32、光照10-12h黑暗和光照交替3、温度24-26℃二、影响因素（三）胚的影响带胚的胚乳产生愈伤组织比不带胚的高。当愈伤组织形成后，除去胚并不影响胚乳组织的增殖。胚对胚乳培养的影响与胚乳的生理状态或年龄有关。处在旺盛生长期的未成熟胚，在诱导培养基上无胚存在时，可形成愈伤组织。对成熟胚乳，特别是干种子的胚乳进行培养时，由于其生理活动十分微弱，在诱导其脱分化前，必须借助于原位胚的萌发使其活化。胚对胚乳的增殖作用，有人认为是某种“胚性因子”在起作用，这种胚性因子可能是赤霉素。二、影响因素（四）胚乳发生类型和发育程度1、发生类型：核型：精核与极核受精后，只以核的分裂方式增殖。占61%细胞型：受精后，以细胞分裂方式增殖。混生目型：两种方式混生增殖。2、发育时期：早期：愈伤组织诱导率低旺盛生长期：最容易诱导产生愈伤组织成熟期：诱导率很低。水稻和桑寄生科的一些木本植物例外胚乳培养中，旺盛生长期是取材的最适时期。三、再生植株的染色体倍数1、稳定型继代培养后染色体无变化，植株三倍体2、畸变型细胞染色体异常，植株为多倍体，且不一致，形成多种倍性细胞组成的嵌合体。四、胚乳培养的应用培养胚乳的首要目的是为了直接获得三倍体植株。三倍体——六倍体——生产倍性多样性——筛选非整倍体植株杂种胚乳—附加系和换代系—遗传育种第三节胚珠和子房培养一、胚珠培养将胚珠从母株中分离出来，放在无菌的人工环境条件下，让其进一步生长发育，以致形成幼苗的过程。根据胚珠是否受精分为两类：受精胚珠的培养未受精胚珠的培养（一）胚珠培养的过程1、胚珠的获取⑴培养受精胚珠，摘取授粉时间合适的子房，如培养未受精胚珠，则在授粉前摘取子房。⑵表面灭菌⑶剖开子房壁，取出胚珠或带胚珠的胎座接种。2、培养条件固体培养基，White，Nitsch（普遍使用），MS培养基。附加天然有机物和氨基酸。蔗糖浓度：幼嫩胚珠4-10%，胚珠内含有合子和少数胚乳核5-6%，刚受精的胚珠8%室温26℃，50-60%相对湿度，光照18h，3、受精胚珠的发育胚珠——种子胚珠——愈伤组织二、子房培养将子房从母株上摘下，放在无菌的人工环境条件下，让其进一步生长发育，以至形成幼苗的过程。根据培养的子房是否授粉分为：授粉子房培养未授粉子房培养（一）子房培养的过程1、子房的获取未授粉子房在开花前1-5天摘取子房，授粉子房在授粉后摘取子房。灭菌：禾谷类幼穗表面用70%酒精擦拭即可，双子叶花蕾漂白粉液灭菌，其他植株暴露的子房须严格消毒，无菌滤纸吸干。拨开幼花，子房接种到培养基上。2、子房的培养固体和液体培养基均可，26℃，50-60%相对湿度，光照16h。N6，MS，BN，Nitsch培养基（二）培养子房的发育子房性细胞——愈伤组织或胚状体——单倍体植株子房体细胞——愈伤组织或胚状体——二倍体植株三、胚珠和子房培养的应用1、胚珠受精胚珠培养目的——打破种子的休眠挽救胚的发育以获得杂交种未受精胚珠培养目的——获得单倍体细胞发育而来的植株2、子房授粉子房培养目的——挽救子房内杂种胚的发育未授粉子房培养目的——获得单倍体植株试管受精解决杂交育种中不亲和问题。第四节植物离体授粉在远缘杂交中，遇到两种障碍（受精前和受精后）离体授粉（离体/试管受精）：将未授粉的胚珠或子房从母体上分离下来，进行无菌培养，并以一定的方式授以无菌花粉，使之在试管内实现受精的技术。三种方式：离体柱头授粉（授于离体雌蕊的位置）离体子房授粉离体胚珠授粉一般都在试管内完成的。一、离体授粉的类型（一）离体柱头授粉1、定义：通过雌蕊的离体培养，使无菌花粉授于柱头上，得到含有可育的种子和果实的技术。2、方法:在花药尚未开裂时切取母本花蕾，消毒后，在无菌条件下用镊子剥去花瓣和雄蕊，保留萼片，将整个雌蕊接种在培养基上，当天或第二天在其柱头上授以无菌的父本花粉。（二）离体子房授粉1、定义：通过人工方法将花粉直接引入子房，使花粉粒在子房腔内萌发，并进行正常受精，最后获得具有生活力的种子。又称子房内授粉。2、两种形式：活体子房内授粉/离体子房内授粉1）活体子房内授粉：指被授粉的子房并不离体，仍然活在植株上，对其用花粉悬浮液进行授粉，使活体子房发育并形成成熟种子的过程。①步骤：确定供试植物的开花和花药开裂时间；对母本花蕾去雄并套袋；采集父本花粉；将花粉引入子房。②花粉粒引入子房有两种方法：直接引入法和注射法直接引入法：用锋利刀片在子房壁或子房顶端上开一切口，把花粉从切口处送进子房。注射法：用100mg/L硼酸将花粉粒配制成悬浮液，每滴含100-300个花粉粒。母本开花后，将子房用酒精棉表面消毒，在子房两侧彼此对应的位置上钻两个小孔，用注射器由一个小孔向子房注射悬浮液，注满子房腔，到另一小孔流出为止，用凡士林封闭小孔。2）离体子房内授粉：指用无菌花粉对离体培养的子房进行授粉，使其发育为成熟种子的技术。方法：取即将开花的花蕾，经过表面消毒，剥离花萼和花瓣，去掉柱头和花柱，在试管中将无菌花粉授予子房顶端切口处，或将花粉引入子房内，实现受精过程。（三）离体胚珠授粉定义：离体培养未受精的胚珠，并在胚珠上授粉，最终在试管内结出正常种子的技术。方法：1、将胎座上切下的单个胚珠（裸露胚珠）接种在培养基上，然后撒播花粉于胚珠表面，实现受精。2、将带有完整胎座或部分胎座的胚珠接种在培养基上，并撒播花粉进行受精。二、离体授粉的方法（一）试验材料的选择最好选择子房较大并有多个胚珠的植物（二）离体授粉的程序1、确定开花、花药分裂、授粉、花粉管进入胚珠和受精的时间2