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第二章植物组织培养基本技术第一节实验室设置及基本技术第二节组织培养所需的环境条件及营养成分第三节培养基的配制与灭菌第四节外植体的选择和灭菌第五节外植体的接种和培养第六节外植体的褐变及其预防措施第七节玻璃化现象及其预防措施第八节试管苗的驯化和移栽第一节实验室设置及基本技术一、实验室组成二、仪器设备三、培养器皿及实验用具四、洗涤技术五、灭菌技术六、无菌操作组织培养实验室布局的总体要求便于隔离便于操作便于灭菌便于观察一、实验室组成基本实验室辅助实验室实验室组成准备室缓冲室无菌操作室培养室细胞生物学实验室温室生化分析实验室基本实验室布局平面图实验台搁架培养架培养架培养架培养架药品及仪器柜无菌台无菌台搁架拉窗冰箱搁架水槽电炉门4.5m3.0m3.5m4.0m准备室缓冲室无菌室培养室组织培养准备实验室缓冲室培养室无菌室（一）无菌室（二）二、仪器设备1、基本仪器设备13669121358冰箱、电（磁）炉、酸度计、纯水器、天平、移液器、解剖镜、光照培养箱、摇床、生化培养箱、培养基分装器、搅拌器等。冰箱酸度计电炉天平纯水器培养基分装器搅拌器2、灭菌设备蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。蒸汽压力灭菌锅干热消毒柜无菌瓶顶过滤装置喷雾消毒器（参考图）（参考图）3、无菌操作设备超净工作台无菌接种箱4、细胞培养设备摇床培养架HZC-250恒温振荡培养箱150C250D光照培养箱5、细胞学鉴定设备光学显微镜、体视显微镜、倒置显微镜倒置显微镜光学显微镜1、玻璃器皿三、培养器皿及实验用具培养皿三角瓶培养瓶2、金属材质用具镊子解剖刀接种针四、洗涤技术1、玻璃器皿洗涤新购置玻璃器皿1%稀HCl浸渍12h洗衣粉洗涤清水冲洗晾干备用已用过的玻璃器皿2、塑料用品洗涤新的塑料器皿打开即用已用过的塑料器皿2%NaOH浸泡12h清水冲洗2%—5%盐酸浸泡30min清水冲洗蒸馏水冲洗晾干备用3、金属用品洗涤热洗衣粉水洗净冲洗擦干五、灭菌技术物理方法：物理灭菌干热、湿热、射线处理、过滤除菌等化学方法：消毒剂、抗菌素灭菌1、灭菌方法2、灭菌（1）培养基灭菌：高温高压湿热灭菌法压力在9.8×104—10.8×104Pa温度在121℃灭菌20—30min（2）玻璃器皿灭菌：蒸汽高压消毒灭菌干热消毒灭菌饱和蒸汽压力与其对应的温度饱和蒸汽压力温度（℃）饱和蒸汽压力温度（℃）kg/cm21b/m2kg/cm21b/m20.00.1410.2810.4420.5630.7030.8440.98402468101214100103.6106.9109.8112.6115.2117.6119.91.0551.1251.2661.4061.5431.6811516182022243050121.0122.0124.1126.0127.8129.6134.5147.6（3）塑料器皿灭菌：多采用高压蒸汽消毒灭菌（4）金属用具灭菌：灼烧灭菌浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼烧，冷却后使用（5）接种室灭菌空气消毒灭菌接种室超净工作台紫外灯照射70%—75%的酒精擦洗培养材料的接种紫外灯照射（6）外植体灭菌流水冲洗10—20min或更长时间70%—75%酒精中浸泡30s0.1%—0.2%氯化汞液中浸泡10min左右蒸馏水冲洗4—5次在10%的次氯酸钠、饱和漂白粉浸泡30min左右备用常用消毒剂消毒灭菌比较表消毒剂使用浓度（%）去除难易消毒时间（min）效果次氯酸钙次氯酸钠漂白粉溴水过氧化氢升汞酒精抗生素硝酸银9~102饱和溶液1~210~120.1~170~754~5（mg/L1易易易易最易较难易中较难5~305~305~302~105~152~100.2~230~605~30很好很好很好很好好最好好较好好六、无菌操作实验员消毒实验室、无菌台灭菌实验器材的灭菌无菌接种消毒实验台卫生培养室培养1、消毒，更换实验服、帽子与鞋子，进入接种室。2、打开超净工作台和无菌操作室的紫外灯，照射40min左右，后关闭。3、开启过滤室风机，使无菌风吹拂工作台面和四周的台壁。4、用70%—75%的酒精擦拭工作台和双手。5、用沾有70%—75%酒精的纱布擦拭盛培养基的培养器皿，放进工作台。6、把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95%的酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。7、在酒精灯火焰附近切割备用的接种材料。8、打开瓶口，用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到。9、取下接种器械，在火焰上消毒。10、把培养材料放入培养瓶，盖上瓶口。11、接种结束后，清理和关闭超净工作台。注意：操作期间应经常用70%—75%的酒精擦拭工作台和双手；接种器械应反复在95%的酒精中浸泡和在火焰上消毒。第二节植物组织培养所需的环境条件及营养成分一、环境条件与自然条件一样，组织培养中的外植体的生长要受到温度、光照、湿度等各种物理条件，不同气体、培养基的组成、pH值和渗透压等各种化学条件，以及外植体部位、大小、细胞密度等各种生物条件等环境条件的影响。如何根据需要来控制培养条件是组织培养中的一个重要问题。温度光照湿度气体渗透压pH值一般最适温度在25±2℃之间环境条件最常用的是光照16h，黑暗8h一般情况下，培养器内相对湿度应达100%，培养室内环境的相对湿度在70%—80%氧气是愈伤组织生长所必需的调节渗透压常常从糖入手培养基的pH值大多在5.0—6.5，5.8二、营养成分植物体内至少含有几十种化学元素，其中大部分元素在植物体内起到一定的生理作用：a、组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质；b、构成一些特殊的生理活性物质，参与活跃的新陈代谢；c、元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡点等化学方面的作用；d、发育方面，特定的元素影响植物的形态发生和组织、器官建成。Arnon和Stout（1939）提出的确定植物必需营养元素的3个标准:阿隆和斯托德A、缺乏该元素，植物生育发生障碍，不能完成其生活史;B、缺乏该元素，就表现为专一的病症，且这种缺素症可以用补充该元素来预防和恢复;C、该元素在植物营养生理上表现直接的效果，而不是由于土壤的物理、化学、微生物条件的改进而产生的间接效果。国内外公认的高等植物所必需的营养元素有16（17）种：C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、（Ni）在植物中含量差别很大，同一元素在植物不同时期、不同条件下含量也不同。根据植物体内含量多少，可把这些元素分为※大量营养元素：占干物质重量的0.1%以上；C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等9种※微量营养元素：占干物质重量的0.1%以下有的只含0.1mg/kgFe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7种按照国际植物生理协会的建议：所需浓度0.5mmol/L的元素为大量元素所需浓度0.5mmol/L的元素为微量元素1、大量元素N是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，在植物生命活动中占有重要的位置。P是磷脂的主要成分。培养基中常用KH2PO4NaH2PO4等。K对碳水化合物合成，转移，以及氮素代谢等有密切关系。Mg、S、Ca是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂，对核蛋白体结构具有稳定作用；S是含S氨基酸的蛋白质的组成成分。Ca是构成细胞壁的成分，对细胞分裂，稳定质膜结构有显著作用，此外，Ca及钙调素在细胞信号转导中起重要作用。2、微量元素在微量元素中，铁的使用最大：◆一些氧化酶的组成成分◆叶绿素形成的必要条件◆使用乙二胺四乙酸铁（EDTA-Fe）鳌合物防止铁的沉淀硼与蛋白质合成、糖类运输有着密切的关系铜是某些氧化酶的成分，能够促进离体根的生长锰参与植物的光合、呼吸代谢钼参与氮素的代谢氯是光合作用水光解的活化剂微量元素的主要作用是作为酶的辅助因子或激活剂参与代谢的调节。缺铁症状：叶面呈绿色网纹状失绿。随病势发展，叶片失绿程度加重，出现整叶变为白色，叶缘枯焦，引起落叶。严重缺铁时，新梢顶端枯死。桃树缺铜症状：新梢顶端叶片的叶尖失绿变黄，叶片出现褐色斑点至扩大变成深褐色，引起落叶。枝顶端生长不良，其下部的芽开始生长，形成丛生的细枝。菊花缺锰症状：叶脉间失绿褪色，但叶脉仍保持绿色，脉间出现坏死斑，缺素症状由幼叶开始。菜豆梨缺锰症缺钼症状：叶较小，叶脉间失绿,有坏死斑点，且叶边缘焦枯，向内卷曲。十字花科植物缺钼时叶片卷曲畸形，老叶变厚且枯焦。白菜缺硼症状：受精不良，籽粒减少，“花而不实”，“蕾而不花”；根尖、茎尖的生长点停止生长，而形成簇生状；常引起各种腐烂病。马铃薯缺锌症状：小叶病，叶片变小，两节之间缩短。叶脉间失去绿色或者变白。植物缺素症•缺氮：首先表现在老叶上均一的缺绿现象；•缺磷：老叶片发蓝稍带紫色，叶缘变为紫红色，叶尖枯死；•缺钾：先表现在老叶斑驳的缺绿症状叶缘枯黄，卷曲皱缩，茎的节间变短；•缺钙：新叶叶片变小、枯死，即干烧心；•缺硫：首先表现为新叶叶片缺绿或发紫；•缺锰：新叶脉间失绿；•缺铁：叶片黄，叶脉绿；•缺硼：顶呀和附近的嫩叶变黑坏死，生长矮化，丛枝；•缺锌：老叶脉间缺绿，出现白色坏死斑；•缺铜：新叶上由叶尖沿叶缘逐渐坏死，严重整叶萎蔫过早脱落；•缺钼：不能形成花器或花早落。3、碳源碳源物质包括糖类物质、醇类物质和有机酸，以糖类物质最重要。糖类物质特点：◆具有遇热易变◆利于吸收和利用◆使用浓度一般在2%-5%◆提供能源和调节渗透压4、维生素类◆以各种辅酶的形式存在◆参与多种代谢活动◆对生长，分化等有很好的促进作用◆主要分为脂溶性维生素和水溶性维生素◆常用维生素有VB1和VB65、肌醇◆环己六醇◆细胞壁的构建材料◆参与碳水化合物、磷脂代谢及离子平衡等生理活动◆促进活性物质发挥作用6、氨基酸◆蛋白质的组成成分◆有机氮源◆可直接被细胞吸收利用◆培养基中常用的是甘氨酸7、天然复合物◆促进某些愈伤组织和器官的生长◆化学成分不明、复杂◆天然营养混合物如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物8、琼脂◆是使用最普遍的凝固剂◆用量一般在6-10g/L之间◆颜色以浅、透明度高的好，洁净为上品除了琼脂外，在组织培养中还可以使用卡拉胶、琼脂糖、结冷胶等。9、活性炭◆吸附培养基及培养物分泌物中的抑制物质◆抑制外植体褐变◆防止玻璃苗的产生◆促进培养物生长和分化◆促进生根10、抗生素◆防止外植体内生菌造成的污染活性炭11、生长素类◆促进细胞伸长和分裂◆促进生根、抑制器官脱落、性别控制、延长休眠、顶端优势、单性结实◆诱导愈伤组织形成◆溶于95%酒精或0.1mol/L的NaOH中，后者的溶解效果更好◆常用的生长素：IAA(吲哆乙酸)NAA(奈乙酸)2,4-D(二氯苯氧乙酸)IBA(吲哆丁酸)12、细胞分裂素类◆促进细胞分裂和分化◆诱导胚状体和不定芽的形成◆延缓组织的衰老并增强蛋白质的合成◆用于离体成花的调控◆溶于0.5-1.0mol/L的盐酸或稀薄的NaOH中◆常用的细胞分裂素：KT(激动素)BA(6-卞基腺嘌呤)2-ip(异戊烯氨基嘌呤)玉米素13、赤霉素类和脱落酸A、赤霉素类◆组织培养中不常使用◆加速细胞的伸长生长◆促进细胞的分裂◆主要是GA3B、脱落酸(ABA)◆抑制细胞分裂和伸长◆促进脱落和衰老◆促进休眠和提高抗逆能力◆培养基形态不同：固体培养基、液体培养基◆培养过程不同：初代培养基、继代培养基◆其作用不同：诱导培养基、增殖培养基、生根培养基◆营养水平不同：基本培养基、完全培养基一、培养基的种类第三节培养基的配制、灭菌与保存1、MS培养基◆无机盐浓度高◆高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐◆含有一定数量的铵盐◆营养丰富◆不需要添加更多的有机附加物二、几种常见培养基的特点2、White培养基◆1943年由White为培养番茄根尖而设计◆1963年作了改良，提高MgSO4的浓度和增加硼元素◆无机盐浓度较低◆使用广泛◆在生根培养、胚胎培养中有良好的效果大量元素含量微量元素含量铁盐含量有机物含量其他含量KNO380H3BO31.5Fe2(SO4)32.5肌醇100蔗糖30000Ca(NO3)24H2O300MnSO44H2O7.0烟酸0.3琼脂8000MgSO47H2O720ZnSO47H2O3