组织培养学实验

植物组织培养实验教师：叶水英实验一、熟悉和整理植物组织培养实验室•一、实验目的：•了解植物组织培养实验室的设置及基本设备，学习基本仪器设备的使用原理与方法，掌握植物组织培养的一些基本技术。•二、实验内容：•（一）组培实验室的设置•我系组培实验：植物实验室、分子生物实验室、组培室三大个实验室组成。•一个标准的组织培养实验室应当包括：准备室、接种室、培养室、驯化室等，准备室又称为化学实验室或通用实验室，可由洗涤室、培养基配制室和灭菌室构成。在实际中可结合可行条件，合并一部分。各分室能满足实验准备（器皿的洗涤与存放、培养基制备和无菌操作、用具的灭菌）、无菌操作和控制培养三项基本工作的需要。•1、准备室•由洗涤室、培养基配制室和灭菌室构成。•（1）洗涤室(cleaningroom)•用于玻璃器皿和实验用具的洗涤、干燥和贮存；培养材料的预处理与清洗；组培苗的出瓶、清洗与整理等。•室内应配备大型水槽，最好是白瓷水槽。为防止碰坏玻璃器皿，可铺垫橡胶。上下水道要畅通。备有塑料筐，用于运输培养器皿。备有干燥架，用于放置干燥涮净的培养器皿。•（2）培养基配制室•用于培养基的配制。•要求房间宽敞明亮、通风、干燥、清洁卫生，便于多人同时操作；有电源、自来水和水槽（池），保证上下水道畅通。有时可将配制室内部间隔为称量分室和配制分室。规模较小时，配制室可与洗涤室合并为准备室。•仪器与用具配置：电子天平、磁力搅拌器、蒸馏水器、酸度计、恒温水浴锅、电炉（或微波炉、电饭煲、液化气炉灶等）、冰箱等仪器设备；移液管（或微量移液器）、移液管架、培养瓶（包括试管）、棕色或透明试剂瓶、烧杯（带或不带刻度）、量筒、容量瓶、培养皿、吸管、打孔器、玻璃棒、标签纸、记号笔、耐高温高压塑料薄膜等封口材料、周转筐、尼龙绳、脱脂棉、纱布、工作台、蒸馏水桶、医用小推车等用品和用具。此外，配备器械柜和药品柜，分别存放接种用具和分类存放化学试剂（可改为药品）。最好配备防尘设备，以减少灰尘污染。•（3）灭菌室•用于培养基、器皿、工具和其他物品的消毒灭菌。•要求安全、通风、明亮；墙壁和地面防潮、耐高温；配备水源、水槽（池）、电源或煤气加热装置和供排水设施；保证上下水道畅通，通风措施良好。生产规模较小时，可与洗涤室、配制室合并在一起，但灭菌锅的摆放位置要远离天平和冰箱，而且必须设置换气窗或换气扇，以利通风换气。•仪器与用具配置：高压灭菌锅、干热消毒柜或烘箱、细菌过滤装置、工作台、培养基存放架或橱柜、周转筐、换气扇、医用小推车等。•2、无菌操作室（transferingroom）•进行植物材料的接种、培养物的转移等无菌操作，因此接种室也称为无菌操作室。其无菌条件的好坏对组织培养的成功与否起着重要作用。•在工作方便的前提下，接种室宜小不宜大，一般7～8m2，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置推拉门，以减少开关门时的空气扰动。•接种室要求干爽安静，清洁明亮。在适当位置吊装1-2盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。•仪器与用具配置：超净工作台、空调机、解剖镜、接种器具消毒器(或高温焚化炉)、紫外光灯、酒精灯、广口瓶、三角瓶、搪瓷盘、接种工具、手持喷雾器、工作台、搁架、接种用的小平车、不锈钢长方形饭盒(盛放70～75%酒精，用于浸泡接种工具)或医院用消毒盒等。配置污物桶，以便存放接种过程中的丢弃物，须每天清洗更换。•进入无菌室前，为了防止带菌空气直接进入接种室和工作人员进出接种室时带进杂菌，接种人员在缓冲间更衣、换鞋、洗手、戴上口罩后，才能进入接种室。应当在此室内安装灭菌用的紫外灯。•3、培养室（culturingroom）•培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。高度比培养架略高为宜，周围墙壁要求有绝热防火的性能。•培养材料放在培养架上培养。培养架大多由金属制成，一般设5、6层，最低一层离地高约l0-20cm，其他每层间隔30cm左右，培养架即高1.7m左右。培养架长度都是根据日光灯的长度而设计，如采用40W日光灯，则长1.3m，30W的长lm，宽度一般为60cm。•培养室最重要的因子是温度，一般保持在20～27℃左右，具备产热装置，并安装窗式或立式空调机。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，最好不同种类有不同的培养室。室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70％～80％为好，可安装加湿器。•控制日光照时间可安装定时开关钟，一般需要每天光照10～16h也有的需要连续照明。现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。在阴雨天可用灯光作补充。•4、驯化室•驯化室要求清洁无菌，配有空调机、加湿器、恒温恒湿控制仪、喷雾器、光照调节装置、通风口以及必要的杀菌剂。•（二）组培实验室常用仪器设备•1、常用仪器设备•（1）超净台•最常用最普及的无菌操作装置,主要通过风机,送入的空气经过细菌过滤装置,再流过工作台面.因此,超净工作台应放置在空气干净,地面无灰尘的地方,以延长使用期.使用过久,引起堵塞,需要清洗和更换过滤器。•（2）高压灭菌锅•是最基本的设备，用于培养基.器械等的灭菌。•（3）空调机•保证室内温度，一般为25±2℃，应安置在室内较高的位置。以便于排热散凉。•（4）光照培养箱•用于植物材料的特定培养，可以控制温度、湿度及光照等。•（5）烘箱•洗净后的玻璃器皿，如需迅速干燥，可放在烘箱内烘干，温度以80-100℃为宜．若需干热灭菌，温度升高至150-160℃,持续1-3小时即可．•（6）冰箱•某些试剂．药品和母液需低温保存，有些材料需低温处理，需要使用冰箱•（7）电子分析天平•电子分析天平，用于称取大量元素、微量元素、维生素、激素等微量药品精确度为0.0001g；托盘天平用于称取用量较大的糖和琼脂等，其精确度为0.1g。天平应放置在干燥、不受震动的天平操作台上。•（8）显微镜及解剖镜，•种类较多，用于分离微茎尖可采用双筒实体解剖镜。双筒解剖镜在分离茎尖等较小组织时，便于观察、操作，通常放大5-80倍。放大40倍以上操作需要有相当熟练的技术和较好的工具。为进行操作，要有照明装置。解剖镜上带有照相装置，根据需要随时对所需材料进行摄影记录。•（9）摇床与转床•用于改善液体培养材料的通气状况及促进酶解原生质体的解离。一般在液体培养中转速为每分钟100次左右，在解离原生质体时为每分钟80左右。•（10）磁力搅拌器•磁力搅拌器用于加速搅拌难溶的物质，如各种化学物质、琼脂粉等。磁力搅拌器还可加热，使之更利于溶解。•（11）培养架•进行固体培养和试管苗大量繁殖时,需要有放置培养瓶的培养架。•（12）酸度计•组织培养中培养基pH值的准确度是十分重要的，应当使用酸度计，若无酸度计，也可使用pH试纸进行粗测。•（13）离心机•用于收集原生质体，转速要求较低。一般为1000～4000rpm即可。•（三）必要的器皿•1、玻璃器皿•长时间培养和贮存药液用的玻璃器皿，要求由碱性溶解度小的硬质玻璃制成，而且能够耐高压灭菌。•（1）培养器皿•装入培养基进行植物材料的培养，根据培养目的和要求不同，可以采用不同种类和规格的玻璃器皿。试管、三角瓶（或锥形瓶）、培养皿。通常以纱布包被棉花塞，外面再包一层牛皮纸，用线绳或橡皮筋扎好。现在多采用聚丙烯塑料薄膜作为封口，以线绳结扎或橡皮圈箍扎。为了增加通气性，可在里面衬一层硫酸纸或牛皮纸。这样经济方便，且通气好。也可采用专用的封口膜。以达到防止培养基干燥和杜绝污染的目的。•目前，培养容器和制备培养基所需的玻璃器皿逐渐被塑料器皿所代替。塑料容器具有质轻、透明、不易破碎、成本低等优点，如培养容器多为平底方盒形，可提高培养空间利用率的植株数，并能一层层地叠摞起来，从而节约空间。这类塑料制品多是采用聚丙烯材料制成，能耐高温，可进行高压灭菌。有些产品为一次性消耗品，不但可节省洗涤人工，还可节省时间，提高效率。一次性塑料容器或带螺丝帽的玻璃瓶，无须另外配盖，使用时比较方便。•（2）盛装器皿•配制培养基时，各种药品的溶解，储备均需要各种规格的烧杯、试剂瓶等。大烧杯用于培养基的熔化，成本高，易破，可以用搪瓷盆代替。•2．计量器皿•母液的配制、药液的分装、吸取需要玻璃计量器皿，如10ml、25ml、50ml、100ml、200ml、500ml、1000ml的量筒，25ml、50ml、100ml、200ml、500ml、1000ml、2000ml的容量瓶，以及0.1ml、0.2ml、0.5ml、1ml、2ml、5ml的移液管，用于配制培养基时吸取不同种类的母液。应多准备几支，分开使用。•3、其他器皿：如滴瓶、称量瓶、玻璃棒、漏斗、玻璃管、注射器等实验室常用器皿应具备。•2、金属器械报告：组织培养常用的金属器械，可选用医疗器械或微生物实验所用的器械。•（1）镊子类：常应用医疗上的镊子。根据操作需要有各种类型，若用l00ml的三角瓶作为培养瓶，可用20em长的镊子。镊子过短．容易使手接触瓶口，造成污染。镊子太长，使用起来不灵活。•（2）剪刀类：可采用医疗五官科用的中型剪刀。主要用于切断茎段、叶片等。也可以用弯形剪刀，由于其头部弯曲，可以深入到瓶口中进行剪切。•（3）解剖刀•切割较小材料和分离茎尖分生组织时，可用解剖刀。刀片要经常调换，使之保持锋利状态，否则切割时会造成挤压，引起周围细胞组织大量死亡，影响培养效果。•（4）接种针•用来转移细胞和愈伤组织。•（四）实验用具的洗涤和灭菌•1、器皿的清洗•植物组织培养最重要的，也是最基本的要求，就是各项操作都应从无毒害、无污染的培养环境来考虑。培养过程中最经常、最大量的工作之一，是洗涤培养瓶及其它常用器皿。在清洗器皿处应有较大的水池，水池应用水泥制作，白瓷砖砌内外表面，池底另放一张橡胶垫，以减少器皿破损。自来水龙头宜采用三孔鹅颈式的，用水方便，并在需要时可加装抽滤器。下水道应畅通，以免妨碍工作。除水池外，还需辅助以若干盆与桶。•最常用的洗涤助剂就是家庭用的洗衣粉及肥皂两种，备一点去污粉也有些用处。如果冷的洗衣粉水效力欠佳，可以增加浓度或适当加热。这已可以处理许多清洗中的问题。没必要使用铬酸-硫酸洗液，因为使用这种洗液要十分小心，而且效率也不高。洗瓶时先将瓶子在清水中泡一会儿，然后在水龙头下涮去瓶内污物，沥干水，泡入浓洗衣粉水中，再用瓶刷沿瓶壁上下刷动和呈圆周旋转两个方向刷洗。瓶外也要刷到，不要留下未刷到之处。刷后放到水龙头下用流水冲刷4次，以彻底冲去洗衣粉残留物。•洗好的瓶子应透明锃亮，内外壁水膜均一，不挂水珠，即表示无污迹存在。通常无须乎再用蒸馏水涮一遍，直接置于搁架上沥晾水汽。也可制作晾洗架，瓶子倒放在孔格中或挂在小木棍上，这样洗后要摆一遍瓶子，用时再收一次瓶子。急等使用的瓶子可以用烘箱烘干。烘时缓慢升温，温度也无须太高。新买进的瓶子亦可按上述方法处理。移液管之类的仪器，可用橡皮吸球(洗耳球)和热洗衣粉水吸洗，再放水龙头下流水冲净，垂直放置晾干。带刻度的计量仪器不宜烘烤，以免玻璃变形，影响计量的准确度。如洗后急等使用，只要用要吸量的液体吸弃数次，或用95%酒精吸弃数次后，即可使用。•2、灭菌•（1）器皿和用具常用灭菌方法：•1、热压灭菌法（学习操作）•将洗净的培养器皿，用具，用牛皮纸包好，放入高压消毒锅中，1.1压力下灭菌20－30分钟。•2、干热灭菌法•洗净的玻璃器皿置于电热干燥箱中，150℃40分钟或120℃两小时，待冷却后使用。•（二）无菌室灭菌（接种室、培养室）•1、用新洁尔灭擦抺工作台，70%酒精擦拭超净工作台。•2、薰蒸（学习操作）•用甲醛、高锰酸钾提前1－3天薰蒸密封房间方法1：甲醛倒入蒸发皿加热，用量10ml/m2。•方法2：甲醛（HCHO）与高锰酸钾（KMn4）以10：1比例混合。•3、接种前用70－75%酒精喷雾，使飘在空气中的尘埃沉积下来。•4、用紫外光灯进行照射灭菌（波长2650－