组织培养育苗

植物组织培养植物组织培养（Planttissueculture）是指在无菌条件下，将离体的植物器官（根、茎、叶、花等）、组织（如形成层、花药组织、胚乳、皮层等）、细胞（体细胞和生殖细胞），以及原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，使其长成完整的植株，统称为植物组织培养。组织培养育苗植物组织培养流程图获取外植体无菌接种诱导愈伤组织的形成试管苗的形成扩大培养移栽脱分化再分化培养基配制组织培养步骤植物组织培养的过程可概括为：脱分化再分化根、茎、叶外植体愈伤组织或完整植物胚状体⊙茎尖、茎段、胚及子房等器官做外植体可不经脱分化直接形成试管苗。⊙植物组织培养原理：一是细胞的全能性；二是再生作用，与植物体分离的器官具有恢复完整植株的能力。⊙组织培养类型：愈伤组织培养、器官培养、茎尖培养、原生质体培养、悬浮细胞培养。如花药培养：培养离体花药易获得单倍体植物。81.无菌操作室缓冲室（间）：接种室（间）：组织培养准备实验室缓冲室培养室无菌室（一）无菌室（二）二、仪器与设备1、基本设备冰箱、电炉、酸度计、纯水器、天平、培养基分装器、搅拌器等。15常用仪器和设备冰箱酸度计电炉天平纯水器培养基分装器搅拌器19培养室2、灭菌设备蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。高压蒸汽灭菌器21223.组培实验室的基本设备器皿和器械类⒈玻璃器皿⒉器械镊子类解剖刀剪刀接种针细菌过滤器4.仪器设备无菌操作设备超净工作台233、无菌操作设备超净工作台无菌接种箱电热烘箱接种器具消毒器26275.培养设备空调加湿器和去湿机定时器培养架摇床或旋转床培养箱蒸汽压力灭菌锅干热消毒柜无菌瓶顶过滤装置喷雾消毒器（参考图）（参考图）6、细胞培养设备摇床培养架HZC-250恒温振荡培养箱150C250D光照培养箱7、细胞学鉴定设备光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜倒置显微镜光学显微镜1、玻璃器皿三、培养器皿及实验用具培养皿三角瓶培养瓶2、金属材质用具镊子解剖刀接种针温室3738培养室准备室灭菌室储藏室接种室缓冲室植物组织培养实验室布局示意图⒊药品贮存和配制仪器设备冰箱天平酸度计⒋观察分析仪器设备体视显微镜普通光学显微镜倒置显微镜⒌其它仪器设备离心机恒温水浴锅3940一、培养基组培中培养基的重要性：基本培养基：指只含有维持离体植物细胞基本生命活动所需的营养成分的培养基。通常包括水分、无机营养成分和有机营养成分，不包括激素和天然有机附加物。完全培养基：指在基本培养基的基础上另外附加激素或天然有机附加物所组成的培养基。优化培养基无蔗糖1%蔗糖5%蔗糖无BAPBAP0.1mg/lBAP5.0mg/l无NAA非洲紫罗兰叶片培养固体培养：液体培养431、培养基的构成水无机盐类大量元素化合物微量元素化合物有机营养成分糖类维生素类氨基酸类硼与蛋白质合成、糖类运输有着密切的关系铜是某些氧化酶的成分，能够促进离体根的生长锰参与植物的光合、呼吸代谢钼参与氮素的代谢氯是光合作用水光解的活化剂微量元素的主要作用是作为酶的辅助因子或激活剂参与代谢的调节。缺铁症状：叶面呈绿色网纹状失绿。随病势发展，叶片失绿程度加重，出现整叶变为白色，叶缘枯焦，引起落叶。严重缺铁时，新梢顶端枯死。桃树缺铜症状：新梢顶端叶片的叶尖失绿变黄，叶片出现褐色斑点至扩大变成深褐色，引起落叶。枝顶端生长不良，其下部的芽开始生长，形成丛生的细枝。菊花缺锰典型症状：叶脉间失绿褪色，但叶脉仍保持绿色，脉间出现坏死斑，缺素症状由幼叶开始。菜豆缺钼典型症状：叶较小，叶脉间失绿,有坏死斑点，且叶边缘焦枯，向内卷曲。十字花科植物缺钼时叶片卷曲畸形，老叶变厚且枯焦。白菜缺硼典型症状：受精不良,籽粒减少，“花而不实”，“蕾而不花”；根尖、茎尖的生长点停止生长，而形成簇生状；常引起各种腐烂病。马铃薯50植物生长调节剂1、生长素类常用类型：NAA,2,4-D,IBA,IAA功能培养基中常用浓度：10-7～10-5mol/L或0.1～10mg/L2、细胞分裂素类常用类型：6-BA,KT.TDZ,2-ip功能培养基中常用浓度：10-7～10-5mol/L或0.1～10mg/L51523、组织培养时，植物激素的使用规律在生长素存在的条件下，细胞分裂素的作用有加强的趋势，但二者在使用上有一定的顺序关系，处理顺序不同，培养物的分化状态也不同。规律如下：⑴先用生长素处理，后用细胞分裂素处理，有利于细胞分裂，但细胞不容易分化,容易产生多倍体细胞。⑵先用细胞分裂素处理，后用生长素处理，细胞分裂也分化。⑶用生长素和细胞分裂素同时处理，细胞脱分化后分化频率提高。但二者的使用浓度比值可以决定器官分化方向：生长素/细胞分裂素比值高时，有利于根分化，抑制芽形成。反之，有利于芽分化，抑制根形成。比值适中时，促进愈伤组织的形成和生长。5354天然有机添加物质椰汁：CM100～150ml/L酵母提取液：YE0.01%～0.5%番茄汁：5%～10%马铃薯汁：100g/L～200g/L香蕉泥（汁）：150mg/L～200mg/L55培养基的配制1、基本培养基母液的配制⑴单配法⑵混配法①按照避免难溶性沉淀形成的原则和物质种类的不同，将基本培养基配方所包括的物质进行分组；56②基本培养基配方中物质划分组数的多少，即配制母液数的多少可根据实际情况而定，如MS培养基可以配制三液式、四液式、五液式等；例如：MS培养基五液式大量元素母液钙盐母液微量元素母液铁盐母液有机营养成分母液57培养基的配制水准备母液混合定容调pH加入琼脂糖加热溶解培养器皿清洗干燥分装封口高压蒸汽灭菌冷却凝固接种培养基具体配制操作过程：P21培养基配制程序58组培实验基本操作技术器皿和器具的洗涤P191.洗涤剂：无磷中性的肥皂粉、洗衣粉和洗洁精2.常用清洗方法洗涤剂清洗法超声波清洗法3.玻璃器皿的清洗新购置的玻璃器皿的清洗用过的培养器皿的清洗已经污染的玻璃器皿的清洗59二、灭菌器具的灭菌方法干热灭菌法高压蒸汽灭菌法（湿热灭菌法）火焰灼烧灭菌法培养基的灭菌方法高温蒸汽灭菌法过滤除菌法60培养基灭菌方法-------湿热灭菌法培养基湿热灭菌最少时间液体容积（ml）121℃所需时间（min）20---50157520250---500251000301500---200035---4061培养基高压蒸汽灭菌（湿热灭菌）操作P20灭菌后培养基的存放：锅内加水放入消毒桶装入培养基盖好锅盖接通电源加热排尽锅内冷空气达到灭菌温度时开始计时并保持足够长的时间继续加热切断电源压力表指针归零时打开锅盖取出培养基并存放好62高压蒸汽灭菌锅安全使用注意事项：①灭菌前外层锅内要加入足够的水,灭菌完成后要将锅内的水排放干净。②在灭菌过程中及灭菌后，压力表压力指针归零之前,不能打开锅盖,以免发生危险。③注意日常维护和检查,及时发现问题,及时修理，保证使用安全可靠。63使用高压蒸汽灭菌锅进行物品灭菌时的注意事项：①消毒锅内放置的物品要有一定的缝隙，便于高温蒸汽上下回流，达到良好灭菌效果。②锅内冷空气必须完全排尽，否则压力表的指针虽然达到了规定的压力，但由于锅内冷空气的存在，并不能达到相应的温度，因而影响灭菌效果。③进行培养基灭菌时，锅内达到规定的灭菌温度后，在严格保持灭菌温度的同时，还要严格保持灭菌时间。时间过长会破坏培养基内一些化学成分的有效性，时间过短则达不到灭菌效果。无菌操作室内的灭菌方法熏蒸灭菌法射线灭菌法外植体的表面灭菌P29化学消毒剂灭菌法抗生素抑菌法64651.外植体灭菌的常用杀菌剂良好的外植体灭菌效果的含义：外植体灭菌后无菌率高，同时植物细胞不会受损伤或只是轻微受损伤而能保持正常生长。662.外植体表面灭菌外植体表面灭菌操作前的准备工作：①无菌水、漂洗瓶、切割用器皿（玻璃培养皿或不锈钢切割盘）和金属器具均经过高温高压灭菌并整齐摆放在超净工作台上。②灭菌剂配制好并整齐摆放在超净工作台上。6768外植体表面灭菌的一般过程预处理：外植体取材备用无菌水充分漂洗3～5次无菌条件下，消毒剂处理无菌条件下，70%酒精表面消毒30S～60S预处理693.影响外植体消毒效果的因素：①消毒剂种类②消毒剂使用浓度③消毒处理时间4.培养过程中污染原因及对策污染的病原类型污染发生原因防污染对策70三、外植体的接种1定义2外植体接种操作前的准备工作接种室的清洁和灭菌超净工作台的清洁和灭菌准备操作人员无菌操作前的准备3外植体接种的具体步骤切割外植体培养瓶倾斜靠近酒精灯火焰瓶盖外部在火焰上旋转灼烧数秒钟旋开瓶盖，扣放在酒精灯旁边瓶口在火焰上旋转灼烧数秒钟用无菌镊子将外植体均匀放置在培养基上瓶盖在火焰上灼烧两圈盖紧瓶盖组织培养繁殖初代培养：芽、茎段、叶片、花器等外植体在离体培养条件下诱导愈伤组织、侧芽或不定芽、胚状体过程对应于种子胚而言。在离体培养过程中产生一种形似胚（具有明显的根端和芽端），功能与胚相同的结构。胚状体［embroid］：石龙芮下胚轴培养产生胚状体过程继代培养：更换新鲜培养基来繁殖同种类型的材料（愈伤组织、芽）。继代培养一般使用固体培养，采取分株、切割嫩茎等方法进行扩大培养。生根培养：当试管苗增殖到一定数量时要进行生根培养。配制生根培养基，即1/2MS+生长素。将芽苗转接到生根培养基上培养成为完整植株的过程。驯化移栽：组培苗经人工炼苗后移栽到驯化苗床上使之适应露地或保护地条件的过程。787980接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中正确错误整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速正确错误接种过程中尽可能达到悬空要求防止操作带来的污染正确错误接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口正确错误瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口正确错误接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生种子和分生组织：培养时通常将其贴放在培养基表面，而不是插到培养基内部，以免供氧不足正确错误接种茎段：注意形态学下端插入培养基内，而形态学上端露于空气中正确错误茎段培养成苗示意图花烛叶片离体快速繁殖胡萝卜形成层(分生组织)培养示意图台湾百合离体培养大蒜愈伤组织培养直接器官发生间接器官发生体细胞胚胎发生败育胚培养972离体培养体系的建立供体植物材料的确定外植体的选择外植体的灭菌外植体的培养外植体的接种98常用外植体的种类茎尖带节茎段节间部茎段叶片和叶柄鳞片生长素的生理作用1、促进细胞生长和细胞分裂2、诱导受伤组织表面细胞恢复分裂能力3、形成愈伤组织，促进生根4、与一定量的细胞分裂素配合共同诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的诱导。1、生长素类：1）吲哚类：IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、IPA（吲哚丙酸）2）萘酸类：NAA（萘乙酸）3）苯氧羧酸类：2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）、2,4,5-T（2,4,5-三氯苯氧乙酸）、2,4,5-TP（2,4,5-三氯苯氧丙酸）等。其中吲哚乙酸在植物体内普遍存在，是生理活性最强的生长素。A：NAA0mg/L，芽（少），根（无）B：NAA0.1mg/L，芽（少），根（无），愈伤组织（少量）C：NAA5.0mg/L，芽（少），根（多），愈伤组织（一定量ABC2、细胞分裂素是一类腺嘌呤衍生物。主要有激动素（6-糠基氨基嘌呤KT）、6-苄基氨基嘌呤（6-BA）和玉米素（ZT）等。其中最常用的是6—苄基氨基嘌呤。功能：1、促进细胞的分裂和分化2、诱导芽的分化3、促进侧芽的萌发和生长4、抑制衰老ABA：BA(0mg/L)，芽（减少），根（增多）愈伤组织（一定量）B：BA(0.1mg/L)，芽（适量），根（适量）愈伤组织（一定量）控制植物细胞分化分裂素/生长素的比例是控制芽和根形成的一个重要条件比例高时——产生芽,比例低时——产生根生理作用：1、诱导茎的细胞伸长，对矮生型植物恢复成高生型特别有效，对根无效2、对形成层的细胞分化有影响，往往同生长素有协同作用。IAA/GA比值高有利于木质部的分化，比值低有利于韧皮部的分化。3、破