组织学技术(特殊染色)

授课人：韩伊林组织学技术（特殊染色）特殊染色用于显示标本中的一些结构，使其在显微镜下与其它组织或细胞区别.特殊染色单一特殊染色复合特殊染色一种染料对一种组织结构或细胞进行染色多种染料对多种组织结构或细胞进行染色糖原染色方法：糖原为细胞内的多糖或粘多糖，肝细胞和肌细胞内的糖原最多。糖原的多少，可以反映机体糖代谢的情况。例如：先天性糖代谢紊乱-葡萄糖-6-磷酸酶缺乏、淋巴肉瘤、间皮瘤、肾上腺瘤，肝细胞内都可聚集过多的糖原。★过碘酸-雪夫反应（periodicacidSchiffreaction，PAS)原理：用过碘酸氧化多糖结构的碳键，使其形成2-醛基，与无色的品红结合生成紫红色品红复合物，沉淀于细胞内糖原分布部位，从而可证明多糖或粘多糖的存在。1、试剂配制（1）1%过碘酸水溶液：过碘酸1g双蒸水100ml将过碘酸溶于双蒸水中（2）Schiff试剂：双蒸水200ml碱性品红1g1mol/L盐酸20ml偏重亚硫酸钠2g（或亚硫酸氢钠）活性炭300mg※双蒸水煮沸后离火，慢慢加入品红，搅拌至完全溶解，冷却至50℃时过滤，加入盐酸，冷却至25℃时加入偏重亚硫酸钠摇荡，密封置于暗处或4℃冰箱内24h。溶液呈草黄色时，加入活性炭摇荡1min快速过滤。避光4℃保存备用。(3)亚硫酸氢纳溶液10%偏重亚硫酸氢纳5ml1mol/L盐酸5ml蒸馏水90ml用前配制(4)1mol/L盐酸36%盐酸85.6ml蒸馏水914.4ml2、染色步骤（1)切片入1%过碘酸液氧化2-5min。充分水洗后，过蒸馏水。（2）入Schiff液10-20min（室温暗处）（3）入亚硫酸氢纳液洗3次每次2min（去非特异性染色）流水冲洗10min，过蒸馏水。（4)Mayer苏木精复染2-3min。流水冲洗，过蒸馏水，吸干。从95%乙醇开始脱水、透明、封片。3、对照用1%淀粉糖化酶处理对照片20min.或用唾液（无气泡）消化对照片30min2次。4、结果细胞内糖原呈紫红色；对照片为阴性5、注意事项：（1）糖原易溶于水，要用冷Carnoy液固定（2）配制Schiff试剂碱性品红杂质太多，或亚硫酸氢纳潮解，都不能使碱性品红脱色；盛Schiff试剂的瓶子不宜过大，以免SO2逸出；若Schiff试剂变成粉红色即失效。Carnoy固定液:取纯乙醇、氯仿、冰醋酸，按6:3:1的比例配制，现配现用。一般固定1-2h。固定后的组织块可直接入95%的乙醇脱水。疏松结缔组织各种成分显示方法：疏松结缔组织中含有：胶原纤维、弹性纤维、网状纤维；巨噬细胞、肥大细胞。一、网状纤维分布：肝、肾、脾、淋巴结等器官内。纤维直径0.2-2.0µm，分支多，交织成网。网状纤维主要由Ⅲ型胶原蛋白组成，表面被覆糖蛋白，在镀银切片呈黑色称为嗜银纤维。Gomoris镀银法显示网状纤维1、取材：淋巴结2、试剂配制（1）硝酸银溶液：硝酸银10.2g，溶于100ml蒸馏水。（2）氢氧化钠溶液：氢氧化钠3.1g，溶于100ml蒸馏水。（3）银氨溶液的配置：取5ml硝酸银溶液，缓慢滴加氨水至溶液变得清亮；再加入5ml氢氧化钠溶液，此时溶液变黑色再滴加氨水至溶液清亮后，补加4滴氨水，加蒸馏水稀释至100ml，保存于棕色瓶中备用。（4）高锰酸钾溶液：高锰酸钾0.5g，蒸馏水95ml，3%硫酸5ml（5）氯化金溶液：氯化金0.2g，蒸馏水100ml（6）草酸溶液：草酸2ml，蒸馏水98ml（7）硫酸铁溶液：硫酸铁2g，蒸馏水100ml（8）甲醛溶液：甲醛20ml，蒸馏水80ml3、染色程序（1）新鲜组织10%甲醛固定，石蜡切片，常规脱蜡入水；（2）入高锰酸钾溶液中5min，水洗1min；（3）入草酸溶液中漂白2min，水洗2min；（4）硫酸铁中媒染2min，水洗1min；（5）银氨溶液中处理1-5min（25℃），蒸馏水洗2次，各2min；（6）甲醛溶液中还原5min，蒸馏水洗2次，各2min；（7）氯化金溶中调色1-3min，蒸馏水洗2次；（8）95%及无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。4、结果淋巴结内可见黑色网状纤维，粗细不等，交织成网。5、注意事项配制氨银时氨液不可过多。二、弹性纤维分布广泛，弹性纤维较细，直径0.2-1.0µm，交织成网。富有弹性，与胶原纤维交织在一起。弹性纤维核心部分由均质的弹性蛋白组成；外周覆盖微原纤维。在皮肤学和检测幼年机体组织中的弹性结构。常用的显示弹性纤维的染色有：地衣红染色、Gomoris醛品红染色、Weigert染色等。地衣红染色显示弹性纤维1、取材皮下组织2、染液配制地衣红染液：地衣红0.1g，70%乙醇100ml，硝酸2ml。3、染色程序（1）石蜡切片脱蜡下行至70%乙醇。（2）地衣红染液，室温，12h或过夜，或37℃,15-30min.（3）70%乙醇分色，必要时可用0.5%-1%盐酸乙醇分色，去除胶原纤维颜色。（4）常规乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。4、结果弹性纤维为棕红色，背景淡棕色。三、胶原纤维胶原纤维，粗细不等，直径0.5-10µm，波浪状，有分支交织成网。胶原纤维由Ⅰ型胶原蛋白组成。胶原纤维对酸性染料的亲和力强，如常用的酸性复红及苯胺蓝等，对胶原纤维有选染性，而其它组织不易着色，从而有利于其他组织的复染。显示胶原纤维的主要方法：如vanGieson法、Mallory法、Masson法等。Masson′s三色染色法显示胶原纤维1、取材：皮下组织或肠系膜铺片2、固定：Zenker\Bouin\10%中性福尔马林缓冲液3、染液配制（1）Weigert铁苏木精A液：苏木精10g,95%乙醇100mlB液：29%三氯化铁水溶液4ml25%盐酸1ml蒸馏水95ml用时甲乙两液等份混合，只能用数天。（2）Masson酸性复红染液：酸性复红1g，冰醋酸1ml，蒸馏水99ml。（3）磷钼酸-磷钨酸水溶液：磷钼酸2.5g，磷钨酸2.5g，蒸馏水100ml。（4）苯胺蓝染液：苯胺蓝2.5g，冰醋酸2ml，蒸馏水100ml。（5）1%醋酸水溶液：冰醋酸1ml，蒸馏水99ml。4、染色步骤（1）石蜡切片脱蜡下行至蒸馏水。（2）Weigert铁苏木精染色，10-20min。（3）流水冲洗，10min，光镜下查看。也可用1%盐酸乙醇（70%）分色。流水冲洗，5min，蒸馏水浸洗。（4）Masson酸性复红染液，15min，蒸馏水洗。（5）磷钼酸-磷钨酸水溶液分色，10-15min，或至胶原纤维无红色。（6）苯胺蓝染液，10-20min，蒸馏水洗。（7）1%醋酸水溶液分色，3-5min。镜下查看分色程度。（8）95%乙醇脱水上行，二甲苯透明，树胶封固。5、结果：胶原纤维为蓝色；肌纤维为红色，细胞核为黑色。6、注意事项：标本为10%福尔马林固定，切片染色前需用Bouin再固定，56℃固定1h，或室温过夜。伊红-醛复红染色法同时显示胶原纤维和弹性纤维Gomori氏醛-复红染液是Gomori在试验期间偶然发现的由碱性品红、三聚乙醛、浓盐酸配制而成。一、试剂配制Gomori醛-复红染液：70%乙醇100ml，碱性品红0.5g，三聚乙醛1ml，浓盐酸1ml。※注意：先将碱性品红溶于乙醇中，然后加入三聚乙醛和浓盐酸，静置1-2d，待溶液变为深紫色后，过滤置于冰箱待用。三、制作过程1、取皮下组织铺于干净的载玻片上，自然晾干。2、放在甲醛-乙醇固定液内固定5min；3、水洗3min；4、置于醛-复红染液中，室温下染色5min；5、水洗5min；6、置伊红染液中，染色30s；7、常规脱水、透明、封片。四、结果胶原纤维为红色，长带状，波浪状走行；弹性纤维为紫色，细丝状，直行，末端卷曲。二、取材皮下组织甲苯胺蓝染色显示肥大细胞肥大细胞内含粗大的嗜碱性、异染性的水溶性颗粒，颗粒内含有组胺、肝素等活性物质，这些物质含有高分子的多硫酸脂和硫酸黏多糖类，能够与甲苯胺蓝、美篮、中性红、硫堇等染料结合。1、取材皮下组织2、固定Carnoy液或10%中性福尔马林液皮下组织铺于干净的载玻片上，自然晾干后固定，或石蜡切片，冰冻切片更好3、染液配制甲苯胺蓝溶液：甲苯胺蓝0.2g60%乙醇100ml混匀即可反复使用。4、染色过程（1）石蜡切片脱蜡下行至蒸馏水；（2）入甲苯胺蓝溶液染色，室温10-30min；（3）蒸馏水洗；（4）丙酮或100%乙醇脱水两次，各2min；（5）二甲苯透明，树胶封固。5、结果肥大细胞颗粒呈紫色，核浅蓝色。胰岛内分泌细胞Masson′s三色染色法胰岛在胰尾部分布较多，胰岛细胞由A、B、D、PP四种细胞组成，细胞间有丰富的毛细血管。用Masson′s，Mallory等特殊染色方法可区别A、B、D细胞。1、取材胰腺2、固定Zenker\Bouin\10%甲醛3、染液配制（1）丽春红酸性品红液：丽春红0.7g，酸性品红0.4g，冰醋酸1ml，蒸馏水99ml，用1%的冰醋酸溶解丽春红和酸性品红。（2）2%亮绿液：亮绿2g，冰醋酸2ml蒸馏水98ml，用2%冰醋酸溶解亮绿。4、染色程序（1）切片脱蜡至水；（2）入0.5%碘乙醇5-10min，自来水洗，蒸馏水洗；（3）入0.5%硫代硫酸钠3-5min；（4）Weigert铁苏木精10-20min，自来水洗；（5）1%盐酸乙醇分化，自来水洗蓝化；（6）入丽春红酸性品红液3-5min，蒸馏水速洗；（7）入1%磷酸钼水溶液5min；（8）倾去磷酸钼，直接用2%亮绿液染3-5min；（9）0.5%冰醋酸冲洗切片，将亮绿全部洗掉；（10）95%乙醇，无水酒精脱水，二甲苯透明，树胶封固。5、结果A细胞染成红色，位于胰岛周边；B细胞染成紫红色，位于胰岛中央；D细胞染成绿色，位于A细胞与B细胞之间。6、注意用10%甲醛固定，再用重铬酸钾液处理，也获得较好效果。甲绿-派若宁染色显示DNA和RNA染色原理：甲绿和派若宁是碱性染料，染色中甲绿-派若宁染色与DNA和RNA的聚合程度有关。甲绿与聚合程度高的DNA亲和力较强；派若宁与聚合程度低的RNA有亲和力。一、固定Zenker\Carnoy(4℃)二、染液配制1、2%甲绿水溶液：甲绿2g，蒸馏水100ml※甲绿提纯法：将甲绿溶解后，放入分液漏斗中，加等量的纯氯仿洗，充分摇荡数分钟，静置，待液体分层，放掉下层紫色氯仿液。按此法反复洗，直至洗不下紫色为止，需洗5次左右。4℃保存。2、2%派若宁水溶液：派若宁2g，蒸馏水100ml此液提纯，应按甲绿方法进行。3、醋酸缓冲液（pH值4.8）：0.2mol/L醋酸41ml，0.2mol/L醋酸钠59ml。4、甲绿-派若宁染液：2%甲绿提纯液7.5ml，2%派若宁提纯液12.5ml，醋酸缓冲液30ml。此液用前配制。三、染色程序1、切片脱蜡入水；2、切片入甲绿-派若宁染液5-10min；3、滤纸快速吸干，纯丙酮速洗分色；4、丙酮二甲苯混合液（1:1）速洗2次5、二甲苯透明，树胶封固。四、染色结果DNA呈蓝绿色，RNA呈红色。※苏木精本身不是染料，不能单独使用，因为对组织的亲和力很小。苏木精必须氧化成苏木红才能染色，常用的氧化剂如：氧化汞、过锰酸钾、碘酸钠、重铬酸钾。氧化的苏木精脱掉二个原子的氢。也可用无水乙醇配成10%干液，使其自然成熟。氧化的苏木精为弱酸性，pH为6.5。氧化后的苏木精还必须加入电解质，如铁矾、銨矾、钾矾等即变成带有强电荷的碱性染料。Mayer–苏木精：苏木精1g蒸馏水1000ml碘酸钠0.2g甲矾50g加温溶解成紫蓝色，加水化氯醛50g及枸橼酸1g，溶液变成红紫色，可长久保存。内弹性膜内膜中膜外膜大动脉和大静脉比较1.内膜2.中膜3.外膜1.内膜2.中膜3.外膜