组织捣碎及细胞破碎

1.2.2组织捣碎及细胞破碎（一）细胞壁的结构和特点（二）细胞破碎机理（三）细胞破碎方法教育技术中心1.植物细胞2.微生物细胞G+细菌和G－酵母细胞真菌菌丝细胞壁（一）细胞壁的结构和特点成分G+G-肽聚糖磷壁酸类脂质蛋白质含量很高（30～95）含量较高（50）一般无（2）0含量很低（5～20）0含量较高（020）含量较高革兰氏阳性细菌的和革兰氏阴性细菌细胞壁构造革兰氏阳性细菌与阴性细菌的细胞壁成分(占细胞壁干重的%)（二）细胞破碎的机理•压缩力和剪切力•改变细胞壁或细胞膜的结构，增大目标产物的溶出率•完全溶解细胞的保护屏障－细胞壁（三）细胞破碎的方法1.物理破碎（1）高压匀浆器（1）高压匀浆法工作原理：剪切，碰撞影响高压匀浆器破碎效果的因素压力：通常采用的压力为55～70Mpa温度：通过匀浆器的次数：1～2阀与阀座间距高压匀浆器原理利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环造成细胞破裂,从低压环境释放出来。（1）高压匀浆法注意：易造成堵塞的团状或丝状真菌；较小的革兰氏阳性菌；含有包含体的基因工程菌。珠磨机工作筒（2）珠磨法搅拌器•原理：在膜腔中装入小玻璃球或小钢球，在搅拌浆的作用下，它将使细胞悬浮液与细胞悬浮液，细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起发生碰撞、剪切，使细胞在某种程度上破碎，再由液珠分离器分开、排出。（这些装置的主要缺点是在破碎期间样品温度迅速升高，通过用二氧化碳来冷却容器可得到部分解决。）•构件：微珠、冷却装置、搅拌浆、液珠分离器、物料进出口。见图高速珠磨机工作原理：剪切，碰撞（2）珠磨法影响因素珠磨效率的因素珠体的大小：实验室规模，珠径为0.2mm较好，工业规模，不得＜0.4mm珠体在磨室中的装量：控制在80%～90%；搅拌速度：操作温度：操作温度在5～40℃范围内被处理细胞的特性：（3）超声波破碎法工作原理空穴现象引起工作液局部区域压力差，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。影响因素仪器的功率介质的离子强度pH值菌体的种类和浓度电声超声波发生器（4）渗透压冲击法细胞高渗溶液脱水低渗溶液吸水破裂反复冻融法干燥法X-press法（冻结-撞击法）2.化学法（1）酶法原理：外加酶法细菌类：溶菌酶，G+需配合EDTA放线菌：溶菌酶外加酶法酵母和真菌：蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等植物细胞壁：纤维素酶，果胶酶；外加酶法注意事项需要选择适宜的酶、酶系统和特定的反应条件；在选择酶系统时，须根据细胞的结构和化学组成来选择；常结合其他方法预先处理；外加酶法外加酶法的特点优点：选择性释放产物；条件温和；核酸泄出量少；细胞外形完整。不足溶酶价格高通用性差产物抑制的存在；如甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。酶自溶法（2）酶自溶法常采用加热法或干燥法比如谷氨酸产生菌，加入0.028mol/LNa2CO3和0.018mol/LNaHCO3配成pH10.0的缓冲液，使成3%的悬浮液加热至70℃，保温搅拌20min，菌体即自溶。又如：酵母自溶需在45～50℃下保温12～24h。化学试剂法（3）化学试剂破碎法表面活性物质EDTA螯合剂有机溶剂变性剂五、选择破碎方法的依据•1．处理量的大小；•2．细胞壁的强度和结构；•3．目标产物对破碎条件的敏感性；•4．破碎后固液分离的难易程度；•5.选择性地释放目标产物。选择性地释放目标产物仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围细胞膜附近，采用温和的破碎方法如酶溶法、渗透压冲击法、冻融法；细胞质内，机械破碎选择性溶解目标产物当目标产物与膜或壁结合时，调整溶液pH值、离子强度、添加与目标产物具有亲和性的试剂如螯合剂、表面活性剂等，使目标产物容易释放出来六、细胞破碎效果的检查1.直接测定法检测破碎前后的完整细胞数量2.目的产物测定法细胞破碎后，通过测定破碎液中目的产物的释放量来估算破碎率。3.测定导电率