神经病理性疼痛大鼠行为学及生长相关蛋白表达的变化

神经病理性疼痛大鼠行为学及生长相关蛋白表达的变化厉彩霞林海王均炉△温州医学院附属第一医院麻醉科[摘要]目的：观察大鼠坐骨神经结扎后神经病理性疼痛行为学以及生长相关蛋白-43(GAP-43)表达的变化。方法：采用坐骨神经结扎损伤（CCI）模型，75只SD大鼠，随机分为三组（n=25）。对照组（con组）：不接受任何手术操作；假手术组（sham组）：只分离坐骨神经，不予以结扎；CCI组：结扎坐骨神经。于术前2d，术后1、3、5、7、10、14、21、28d测定各组大鼠热缩足反射潜伏期（TWL），机械缩足反应阈值（MWT），并于术后3、7、14、21、28天各组随机抽取5只大鼠杀死，采用免疫组织化学方法测定脊髓背根节GAP-43表达的变化。结果：与sham组和比较，CCI组术后各日TWL，MWT明显降低(P0.01或0.05)，sham组和con组行为学无显著差异(P0.05)。CCI组较其它组GAP-43表达增高，且此蛋白在CCI组中术后第三天表达开始增高，第七至十四天达最高峰，以后逐渐下降。结论：CCI造模成功后大鼠痛觉及机械痛觉均过敏，且GAP-43表达增高。[关键词]神经病理性疼痛行为学改变GAP-43Behaviorlobservationandchangesoftheexpressionofgrowthassociatedprotein-43indorsalrootganglionofratsfollowingligaionofsciaticnerveLicai-xia,Lin-hai,Wangjun-luDepartmentofAnesthesiology,FirstAffiliatedHospital,WenzhouMedicalCollege,Wenzhou325000,China[Abstract]ObjectiveToinvestigatethebehaviorlobservationandchangesofgrowthassociatedprotein-43indorsalrootganglionofratswithligaionofsciaticnerve.MethodsSeventy-fiveSDratswererandomlydividedinto3groups:Controlgroup(Con),Shamoperationgroup(Sham),Chronicconstrictioninjurygroup(CCI).CCImodelwasadopted,thermalwithdrawallatency(TWL)andmechanicalwithdrawalthreshold(MWT)ofratsweremeasuredon1,2pre-operativeand1,3,5,7,10,14,21,28post-operativedays.Fiveratswererandomlypickedfromeachgroupon3,7,14,21,28post-operativedaysandtheimmunochemistrywasadoptedtodetectthechangeofGAP-43expressiononspinaldorsalhom.ResultsTWLandMWTinCCIweresignificantlowerthanShamgrouponeverypost-operativeday(P0.01or0.05);TherewasnosignificantdifferenceinMWTandTWLbetweenShamandCongroups(P0.05).TheexpressionofGAP-43washigherinCCIthanothergroups,andinthisgrouptheexpressionofGAP-43wasincreasedinthethirdday,fromtheseventhdaytothefourthdaytheexpressionarrivedtothehighest,thenitbegantodecline.ConclusionThesuccessofCCIappearedratsthermalandmechanicalhyperalgesiaandtheexpressionofGAP-43wasincreased.[Keywords]Neuropathicpain;Changeofbehavior;GAP-43神经系统物理损伤、代谢异常、缺血、病毒感染引起神经病理性疼痛，其特征为自发痛、触诱发痛及痛觉过敏。它是人类较常见的疼痛性疾病，但其发病机制复杂而使临床缺乏有效的治疗手段。神经病理性疼痛机制存在多种学说,其中以中枢敏化学说研究较多,张德仁等[1]研究认为GAP-43可以阻断神经病理性疼痛中枢敏化的形成，且刘光久等[2]在大鼠的坐骨神经再生的研究中发现，当轴索受△通讯作者损后脊髓前角运动神经元出现快速的应激反应，即胞体中GAP-43mRNA在术后表达增高。神经受损后，GAP-43蛋白合成增加并沿轴突运输至生长锥，促进神经再生及神经突触连接重建，此外，GAP-43与突触可塑性关系密切,研究表明神经损伤后引起的疼痛也与GAP-43的表达有关[3]。因此通过对慢性坐骨神经损伤CCI模型大鼠的行为学及生长相关蛋白改变的研究可以探讨神经病理性疼痛的可能发病机制，从而为神经病理性疼痛的发病机制和临床上的治疗提供理论依据。材料与方法1、动物、试剂与仪器健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠75只，体重220-250g,由温州医学院实验动物中心提供。戌巴比妥钠购自国药集团试剂有限公司。336爪/尾刺激痛觉测试计以及2390Electrovonfrey测痛计购自美国ⅡTC公司。一抗小鼠抗大鼠生长相关蛋白((growthassociatedprotein-43,GAP-43,Sc-17790)试剂购自Santacruzbiotechnologyinc,f二抗山羊抗小鼠试剂购自ProteintechGroupInc,HMIAS-2000型全自动医学彩色图像分析系I统。2、动物分组及实验SD大鼠随机分为3组：（1）对照组（con组）：不接受任何手术操作；（2）假手术组（sham组）：只分离坐骨神经，不结扎；（3）CCI组：结扎坐骨神经。参照Bennett和Xie[4]描述的方法制作CCI模型，切开皮肤，分离坐骨神经，以4号铬制线结扎4道，每道间隔约1mm。sham组步骤与CCI组相同，但仅暴露神经而不加结扎。术后单笼饲养。3、行为学测定分别于术前第1、2d及术后1、3、5、7、10、14、21、28d测定，测定时间恒定于每日10：00-14：00，室温维持24±0.5℃。（1）热缩足反射潜伏期（thermalwithdrawallatency,TWL）的测定：采用336爪/尾刺激痛觉测试计测定大鼠TWL。参数设定：加热头空闲时激光发射强度为20%；加热头测试工作时激光发射强度为60%；切断时间30s,将实验大鼠置于透明玻璃板上，照射大鼠双侧后足足底，足底出现抬腿回避时间为TWL。每次刺激间隔5min，测3次取平均值。（2）机械缩足反射阈值（mechanicalwithdrawalthreshold,MWL）的测定：置大鼠于透明的有机玻璃箱中，底为11cm2的铁丝网，实验前使之适应15min。采用2390Electrovonfrey测痛计，由下往上垂直刺激大鼠足底皮肤，逐渐加大刺激强度，观测回缩反应（如舔足、甩腿等）时的刺激强度值为MWT，每次刺激间隔10s,测5次取平均值。4、取材、组织制备及免疫组织染色到达实验存活期的大鼠，腹腔注射1%的苯巴比妥钠40mg/kg,深麻醉后，开胸经升主动脉灌注固定。先用100ml%肝素0.9%NaCL溶液快速冲洗血液，再用4%的多聚甲醛的磷酸缓冲液(PH=7.4)固定.取出与坐骨神经相连的背根神经节(L5、L6)。在上述甲醛溶液中固定4-6h常规石蜡包埋，将组织块连续切片，每一组织各取5张片，按GAP-43试剂说明书行免疫组织化学染色。采用两步法，切片常规脱蜡至水，TBS盐缓冲液洗4-5次，高压修复十分钟，依次滴加RegentF与B各孵育半小时，加一抗4℃过夜。用TBST冲洗4-5次，滴加RegentC，室温孵育一小时，再用TBST冲洗4-5次加RegentD室温孵育半小时。再加E1、E2、E3混合物，显微镜下观察控制显色，流水冲洗终止显色。苏木精轻度复染，脱水，透明，中性树脂封固。显微镜观察。阳性细胞胞浆着色为棕黄色。对照实验用TBS替代一抗行免疫组化染色，结果为阴性。5、统计学分析全部数据以均数±标准差（ˉx±s）表示，组间比较用单因素方差分析，继以最小显著法（LSD）行两两比较。用SPSS12.0统计软件包进行数据处理，P〈0.05为差异有统计学意义。结果1、各组间TWL、MWT基础值差异无显著性（P0.05）,所有动物术后均未见肢体运动障碍和自残现象。2、CCI后TWL的变化Con组及Sham组各时间点的TWL变化差异无显著性（P0.05）。CCI组TWL从术后第1日开始下降，第5日降至最低值（为基础值的47.9%,与基础值比较P0.01）,以后缓慢回升，但直至第28日仍低于基础值。与Sham和Con组比较均显著下降，差异有统计学意义。（见图1）。图1CCI大鼠热痛敏的变化024681012141618-1135791113151719212325272931PostoperativeDayMeanLatencyThermalPawWithdrawal(Sec)CCIConSham***************(ˉx±s,n=5)*P0.05,**P0.01与Con和Sham组比较3、CCI后MWL的变化Con组及Sham组各时间点的MWT差异无显著性（P0.05）。CCI组MWT从术后第1日开始降低，并稳定维持28日以上，术后各日MWT均较基础值显著降低（P0.01）(见图2)。图2CCI大鼠机械痛敏的变化010203040506070-1135791113151719212325272931PostoperativeDayMeanthresholdofVonFreyPawWithdrawalCCIConSham****************(ˉx±s,n=5)*P0.05,**P0.01与Con和Sham组比较4、各组GAP-43表达的变化棕黄色颗粒为阳性表达产物。假手术组与对照组GAP-43只有少量表达,手术组随时间的变化而出现GAP-43表达的。图象分析显示GAP-43灰度值（见表1)。表1、GAP-43灰度值分组Group假手术组Shamgroup对照组Contolgroup手术组Chronicconstrictioninjurygroup3天7天14天21天28天灰度值Graylevel159.67±5.34160.83±6.01167.43±0.56*178.35±0.69**179.28±0.53**171.48±0.37*169.78±0.57***与假手术组、对照组比手术组P〈0.01*与假手术组、对照组比手术组P〈0.05图1对照组:散在阳性GAP-43表达图2假手术组:散在阳性GAP-43表达Fig1.Contolgroup:alittleofpositiveFig1.Shamgroup:alittleofpositiveGAP-43expressionneuronsGAP-43expressionneurons图3.用TBS代表一抗:无GAP-43阳性表达图4.术后三天组中等量GAP-43阳性表达Fign3.noGAP-43expressionneuronsFign4.amediumtGAP-43expressionneurons图5.术后七天组大量GAP-43阳性表达图6.术后十四天组大量GAP-43阳性Fign5.alotofGAP-43express