分子生物学实验原理

分子生物学实验原理第一节分子生物学发展概述分子生物学molecularbiology是在分子水平上研究生物的结构、组织和功能的科学。1950年，Astbury在一次学术报告中，首次提出并使用了分子生物学这一名词术语。广义和狭义之分医学分子生物学是应用分子生物学技术和理论来阐明人体正常生理活动和病理过程及其调控的分子机理。分子生物学理论与实际应用的成就理论方面1.关于肿瘤的发生：提出了肿瘤起源于细胞增殖和分化调控的失常和细胞同它周围组织关系的紊乱。•癌基因：100多种；抑癌基因：20多种•细胞周期调控系统•细胞凋亡•端粒酶2.关于艾滋病AcquiredImmuneDeficiencySyndromeHIV序列；疫苗3.关于慢性病chronicdisease，如心血管疾病、肥胖、糖尿病、骨质疏松，发现了相关基因及其多态性。4.关于生长、发育与进化的统一理论，也深入到了分子水平。实际应用方面1.转基因植物目前已鉴定和克隆化的用于转基因植物的基因有100多个。抗除草剂、抗昆虫、抗病毒、抗不良环境因素（抗寒、抗盐碱地、抗旱、抗涝）、提高作物的产量、提高蛋白质含量、改善氨基酸构成等。2.转基因动物1983年，超级小白鼠，体重是正常鼠的2倍。随后出现转基因猪、羊、鸡、兔、牛、鲤鱼等。我国目前研究了金鱼、鲤鱼、圆头鲂。3.基因工程多肽药物与疫苗主要指DNA体外重组技术所研制的产品，转基因动物和植物所研制的产品，以及蛋白质工程技术所研制或改进的产品。4.基因诊断与基因治疗基因诊断genediagnosis是指通过直接探查基因的存在状态或缺陷，从而对疾病作出诊断的方法。目的物：DNA或RNA方法：核酸分子杂交技术、PCR技术、DNA芯片技术疾病：遗传性疾病；传染病或感染性疾病基因治疗genetherapy指将正常的外源基因导入生物体靶细胞内，以弥补所缺失的基因，关闭或降低异常表达的基因，以达到治疗疾病的目的。治疗疾病：遗传病恶性肿瘤传染病5.环境监测与净化areasurveyanddepollution监测：可检测环境中的病毒和细菌净化：改造细菌分解环境中的石油、残留的农药和有毒金属6.克隆动物Cloneanimal1997年“多利”克隆羊克隆器官（干细胞stemcell技术）7.人类基因组计划humangenomeproject;HGP1990年，美国国立卫生研究院（NIH）和美国能源部联合发表了人类基因组计划。30亿个碱基对，估计有3万～4万个人类基因。2000年6月26日，首次绘成人类基因组“工作框架图”。2003年4月14日，中、美、日、德、法、英等6国科学家及领导人宣布人类基因组序列图绘制成功，人类基因组计划的所有目标全部实现。意义与“阿波罗”登月计划相媲美1996年诺贝尔化学奖得主罗伯特·柯特认为，20世纪是物理学和化学的世纪，21世纪将是生物学的世纪。推动分子生物学更加快速地发展：蛋白质组学、代谢蛋白质组学、药物蛋白质组学、毒物蛋白质组学、营养蛋白质组学及各种计划对其他相关学科的影响1.向其他学科渗透2.形成了许多新兴的边缘学科基础医学方面：肿瘤分子生物学、免疫分子生物学、神经分子生物学等预防医学方面：分子营养学、分子毒理学、分子流行病学、遗传流行病学、人类基因组流行病学、公共卫生遗传学在预防医学中的应用及发展方向1.慢性病的研究慢性病的发病原因绝大多数是基因与外界环境因素相互作用的结果。2.环境因素对人类遗传物质损伤的研究及“三致”毒性的研究：生物标志物的研究和评价方法的建立3.环境监测与污染物的净化。4.遗传病的产前诊断（基因型预防）及早期诊断（表型预防）。5.某些重要疾病的生物工程疫苗的研制。6.对环境因素敏感基因及易感人群的研究环境基因组计划（环境基因组学）（1）环境应答反应基因（2）筛选多态性及易感性（3）根据易感性制定不同的干预计划一、分子生物学一些重要的理论知识1.分子生物学发展史上一些重要的事件（1）1865年，“遗传学之父”G.Mendel根据豌豆杂交试验结果，创立了遗传因子学说，即遗传的分离律和自由组合律。（2）1903年W.Sutton提出染色体是Mendel遗传单位的载体的概念。（3）1909年，W.Johannsen将这种在染色体上的遗传单位定名为基因（gene）。（4）1910年，现代实验遗传学奠基人TH.Morgan和他的研究生在研究果蝇的遗传规律时发现了基因的连锁律和交换律。（5）1944年，OT.Avery等人（3人）分离出细菌DNA，并发现DNA是携带生命遗传物质的分子。（6）1950年，Astbury在一次演讲中，首次使用了“分子生物学”术语。（7）1953年，Watson和Crick提出了DNA结构的双螺旋模型，揭示了遗传物质自我复制的机制。（8）1961年至1966年，Nirenberg和Crick等人破译了DNA遗传密码，1966年破译了64个遗传密码。提出了遗传信息由DNA→RNA→蛋白质传递的中心法则。（9）1969年，JonathanBeckwith及其同事在哈佛大学成功分离出第一个基因。（10）1970年，发现了逆转录酶。（11）1961年，F.Jacob和J.Monod提出了乳糖操纵子学说。（12）自1946年起的20年当中，陆续发现了许多质粒；1968年至1970年又发现了许多限制性内切酶，为DNA体外重组提供了有利工具。（13）1973年，重组DNA技术问世。（14）1986年，K.Mullis等建立了PCR技术（15）1990年，人类基因组计划。2.三个重要理论importanttheory(1)DNA的结构、复制、中心法则基本构成单位是核苷酸核苷酸由脱氧核糖、碱基和磷酸构成。碱基分别是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)。相邻的两个核苷酸以磷酸二酯键相连进一步盘旋、折叠，形成三级或四级结构RNA与DNA有如下不同点：五碳糖为核糖(不是脱氧核糖)；碱基中有尿嘧啶U(uracil)而没有胸腺嘧啶RNA为单链，不是双链，但RNA单链之间相邻的碱基可由氢键作用形成局部双链。DNA存在于细胞核的染色体、线粒体以及染色体以外的质粒中(质粒是一些双链，闭环的DNA分子)。DNA(或RNA)结构给我们的启示①DNA(或RNA)是水溶性的。这是由于含有磷酸基因、羟基和氨基。在核酸提取过程中，我们保留的是水相、而不是有机相。②核酸是两性电离，既带正电荷，又带负电荷。它的等电点(PI)为2～2.5。在中性溶液中带负电荷。对核酸进行电泳时，点样时应点在负极；杂交时选择尼龙膜时，最好选择带正电荷的尼龙膜。(核酸带负电荷，容易吸附到带正电荷的膜上，牢固，不掉)③DNA在细胞中存在部位不同(细胞核、线粒体、质粒)，所以应注意提取方法的不同④由于DNA空间构象不同，在电泳时迁移率不同。⑤根据碱基互补配对原则，可设计引物和探针杂交。⑥由于DNA的双螺旋结构和RNA易由于分子内氢链作用形成二级结构，所以在进行杂交等反应时，首先应加热变性，破坏二级结构。在解旋酶的作用下，打开DNA双链在特定的复制起始点以每条DNA链为模板在DNA聚合酶的催化下以4种脱氧核苷酸为前体物，合成一条互补DNA链。DNA的复制双称为半保留复制。DNA的复制DNA半保留复制DNA在复制起始点，由解旋酶打开双链，形成复制叉，合成新链的方向为5’-3’端前导链与后随链后随链的合成是不连续的。•先合成RNA引物•再合成不连续的小片段(冈崎片段，100～1000核苷酸长度)•最后在DNA连接酶作用下，将小片段连接起，形成完整的DNA链。DNA半不连续复制DNA的复制给了我们一些启示①PCR技术的原理：在体外要靠温度(90℃以上)打双链，而不是解旋酶，也是以DNA为模，需要引物，需DNA聚合酶，需要dNTP为前体。PCR与体内(细胞内)DNA复制的最大差异是温度。②检测核分裂指数：在细胞培养中，加入3H标记的dNTP前体物，被细胞摄取后，参与DNA复制，复制速度越快，参入的3H标记的dNTP越多，可用液闪计数仪检测放射性强度，据此判断。遗传信息的传递是：DNA→RNA→多肽(蛋白质)在逆转录酶的作用下，RNA可形成cDNA，然后再由RNA→蛋白质以上就是完整的中心法则理论，亦可称为基因的表达(expression)。中心法则中心法则转录(transcription)以DNA为模板，合成RNA的过程。非模板链称为有意义链，而模板常称为反义链。转录的过程大致是这样的：以DNA一条链为模板，诱导RNA聚合酶活性、RNA聚合酶识别并结合在转录起始位点以ATP、GTP、CTP和UTP为前体，合成(转录)RNA当遇到转录终止信号时，转录即停止。有意义链反义链转录后的初级产物剪切掉内含子，并将外显子连接起来，这样才能变成成熟的RNA分子还需要在5’-端加一个特殊的核苷酸，7-甲基鸟嘌呤核苷酸，这个过程叫戴帽另外，mRNA的，这一过程又叫穿靴，3’-端还要加上一串腺苷酸(AMP)poly(A)或多聚腺苷酸化。同一机体不同的细胞具有相同的DNA或基因，但基因在不同细胞的表达是不同的，具有组织特异性，使不同的细胞具有不同的功能由RNA→蛋白质的过程，又叫翻译。只有聚合酶II催化的反应产物是mRNA，而只有mRNA才翻译成蛋白质。基因(DNA)上三个相邻的碱基组成一个密码子，一个密码子决定一种特定的氨基酸，共有43=64个密码子。在转录过程中，基因上的三联密码子转录成mRNA上的三联密码子。mRNA由核内转移至细胞浆中的核糖体上，以三联密码子指导合成蛋白质。翻译后的蛋白质需要加工修饰。中心法则给了我们一些启示：①遗传信息由DNA上的基因决定。一旦基因发生突变，将最终导致所翻译的蛋白质发生改变，从而导致生理功能改变，甚至出现疾病，如癌症、肥胖等。②mRNA更能准确简便地反映DNA上基因所携带的遗传信息。因此对基因序列的分析，常分析mRNA的序列即可。③基因的表达有组织特异性，且受许多因素的影响，使mRNA的表达增强、降低甚至关闭，从而影响机体正常生理功能，甚至出现疾病。因此常需要检测mRNA的表达的丰度(含量)，常用方法有Northernblot、RT-PCR。定量(Realtime)PCR等。这里需要特别强调：在检测mRNA(或蛋白)表达时，一定要先弄清该基因在某种组织中是否有表达。④根据中心法则，可以RNA为模板，在逆转录酶作用下形成cDNA，于是建立了RT-PCR的方法。⑤根据mRNA的3’端有poly(A)的特点，在进行反转录时，就以poly(A)为模板设计了引物。并且纯化mRNA的方法，也是根据poly(A)的原理设计的。⑥根据最后的翻译蛋白质去向的不同，建立不同的蛋白质提取方法，如在线粒体，在细胞核、在细胞浆、分泌到血液中。（2）基因表达调控以乳糖操纵子学说为例乳糖操纵子的基本组成元件调节基因结构基因IPOⅠⅡⅢ抑制基因(I)：是阻遏物编码区启动基因(P)：有cAMP受体蛋白(CRP)和RNA聚合酶的结合位点操纵基因(O)：是阻遏物结合位点Ⅰ：β-半乳糖苷酶结构基因Ⅱ：透过酶结构基因Ⅲ：转乙酰酶的结构基因调节方式当乳糖↑时,cAMP含量增高↑→cAMP与CAP(分解产物激活剂蛋白)结合成CRP该复合物与启动基因上对应的位点结合后使DNA双链不稳定；随后RNA聚合酶则容易与启动基因紧密结合；若此时操纵基因上无阻遏物，则基因被打开RNA聚合酶从DNA的5’端开始滑动，即开始转录，并合成了3种酶。当葡萄糖↑→cAMP↓→CRP↓RNA聚合酶则不能与启动基因结合，也就不能转录和合成3种酶。抑制基因转录和翻译成阻碍蛋白，并与操纵基因结合,阻止RNA聚合酶滑动而抑制转录。这种情况又称为负调节如果阻遏蛋白与诱导物结合(此处为乳糖)。则这个复合物不能与操纵基因结合，转录和翻译就能进行。操纵子学说扩大了基因的概念。即结构基因和调节基因调节基因发挥正、负调节受细胞内外环境因素的影响。形成了基因调控和表达的概念。基因表达调控理论，不仅有助于理解生命现象的本质