分子生物学第2章染色体与dna2

第2章染色体与DNA第一节遗传的基本单位——基因第二节原核生物基因的结构特点第三节真核生物基因的结构特点第四节DNA复制第五节DNA的损伤与修复第六节DNA的转座复制（replication）：遗传信息从亲代DNA传递给子代DNA的过程，称为复制。一、DNA复制的基本特点二、DNA复制的几种主要形式三、原核生物DNA的复制特点四、真核生物DNA的复制特点五、DNA复制的调控第四节DNA的复制半保留复制(semi-conservativereplication)复制的高保真性(highfidelity)双向复制(bidirectionalreplication)半不连续复制(semi-discontinuousreplication)一、DNA复制的基本特点（一般特征）DNA半保留复制概念：当细胞分裂DNA进行复制时，双螺旋结构解开而成为两股单链，并各自作为模板，用以指导子代合成新的互补链。这样在子代细胞出现新的DNA双链中，其一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则是完全重新合成的，且与母链按碱基配对原则互补。也就是说两个子细胞的DNA双链，都和亲代母链DNA碱基序列完全一致，这种复制方式称为半保留复制（semiconservativereplication)。DNA半保留复制的证据含15N-DNA的细菌第一代培养于普通培养液第二代培养于普通培养液普通DNA的沉降位置普通DNA重DNA重DNA密度梯度离心结果15N-DNA14N-DNA半保留复制的意义通过半保留复制，子代保留了亲代DNA的全部遗传信息。DNA分子中的遗传信息通过转录和翻译（基因表达）决定细胞的蛋白质结构和功能，即DNA通过复制和基因表达决定了生物的特性和类型，从而体现了遗传过程的相对保守性。遗传信息的相对稳定，是物种稳定性的分子基础。※在强调遗传恒定性的同时，不能忽视其变异性。ATGCATATCGTATAATGCATATCGTATAATGCATATCGTATA通过半保留复制，子代和亲代DNA完全一致从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子复制时，解链酶等先将DNA的一段双链解开，形成复制点，这个复制点的形状象一个叉子，故称为复制叉复制的起点、方向和速度•领头链(leadingstrand)：顺着解链方向连续复制的链。•随从链(laggingstrand)：与解链方向相反不连续复制的链。5´5´555´3´3´3´领头链随从链解链方向复制方向与解链方向关系复制叉DNA的半不连续复制双向复制与半不连续复制复制叉复制叉复制方向和速度：单起点、双向等速多起点、双向等速二、DNA复制的几种主要形式1、θ型复制大肠杆菌DNA在复制时可形成类似希腊字母θ形状。（一）线性DNA双链的复制（二）环状DNA双链的复制3´-OH5´-P3´-OH5´-P2、滚环复制第一阶段：以亲本单链（＋）为模板，合成互补链（－），形成闭合的双链环状复制形。第二阶段：滚环复制。一个负链可以合成许多正链，正链用于噬菌体包装。是单向复制的特殊方式。如：ΦΧ174的双链环状DNA复制型（RF）（1）模板链和新合成的链分开;（2）不需RNA引物，在正链3‘－OH上延伸（3）只有一个复制叉;dNTPDNA-polγ3、D环复制:也单向复制的一种特殊方式。首先在动物线粒体DNA的复制中被发现。（一）DNA双链的解旋1、DNA拓扑异构酶(DNAtopoisomerase)：简称拓扑酶Topo.•种类：分Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型。•作用：改变DNA分子的拓扑构象，使DNA超螺旋结构松弛，克服打结，配合复制。三、原核生物DNA的复制特点解链过程中正超螺旋的形成拓扑异构酶Ⅰ型的作用特点：⑴大肠杆菌中的TopoⅠ主要是松弛负超螺旋，而对正超螺旋无作用，故在复制叉的行进中不起作用；但真核生物的TopoⅠ对负超螺旋及正超螺旋均有作用。⑵切断DNA双链中的一股；TopoⅠ对单链DNA的亲和力比双链高得多，这是它识别负超螺旋DNA的分子基础。⑶互补链通过缺口，适当时候又把切口封闭；⑷不消耗ATP。拓扑异构酶Ⅰ的作用拓扑异构酶Ⅱ型的作用特点：⑴在无ATP时，切断DNA双链的两股，未断的DNA双链穿过缺口，在ATP供能时将切口封闭。⑵在模板的复制起始点附近使DNA引入负超螺旋，这对于复制的引发是必要的。⑶在复制延长过程中，TopoⅡ可松弛复制叉前方的正超螺旋，以利于复制叉的行进。⑷复制末期，处理母链与新链的打结。2、DNA解链酶(DNAhelicase):解链酶有多种，包括大肠杆菌解链酶Ⅱ、Ⅲ、DnaB蛋白或Rep蛋白等。它们在起始点上结合并打开DNA双链，此过程消耗ATP。解链酶多延随从链以5′→3′方向移动，只有Rep蛋白延前导链以3′→5′方向移动。DnaA蛋白辨认复制起始点，DnaC蛋白辅助解链酶。3、单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)SSB也称螺旋反稳定蛋白(helixdestablizingprotein,HDP)。其作用是在复制中维持模板处于单链状态，并保持单链的完整。大肠杆菌的SSB是由19KD亚基构成的四聚体，对单链DNA亲和力强。解开的双链分别与SSB结合，结合范围8-16个核苷酸。SSB对单链DNA的亲和力强，而对双链DNA及RNA的亲和力弱。原核生物中，SSB与DNA的结合表现出协同效应。原核生物DNA只有一个复制起始点，称OriC(originC)。大肠杆菌DNA复制起始时，DnaA辨认并结合OriC，而且DnaA只与处于负超螺旋状态下的DNA相结合。•复制起始时，模板起始部位DNA负超螺旋构象的形成，主要由TopoⅡ引入。•DNA复制必须以单链为模板，大肠杆菌解链酶分解ATP获得能量，将双链解开。（二）DNA复制的引发E.coli复制起始点oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245串联重复序列反向重复序列5353复制起始点双链解开、复制起始大约20个DnaA蛋白在ATP的作用下与oriC处的4个9bp保守序列相结合在HU蛋白和ATP的共同作用下,Dna复制起始复合物使3个13bp串联重复序列变性,形成开链解链酶六体分别与单链DNA相结合(需DnaC帮助),进一步解开DNA双链引发前体的生成：引发前体(preprimosome)包含有多种蛋白质因子，其中至少包括DnaA、DnaB、DnaC。复制起始时DnaA的作用：①DnaA辨认并结合OriC中的四个9mer，形成20-30亚基的起始复合物。②DnaA促使OriC中的三个富含AT的13mer局部发生解链，形成解链复合物，此过程有ATP参与。③DnaA引导DnaB·DnaC复合物进入局部解链区，形成引发前体复合物，之后DnaB发挥解链酶的作用，继续解链。引物（primer）的合成：•引物酶复制是在一段RNA引物的基础上进行的，催化引物合成的是一种RNA聚合酶，它不同于催化转录过程的RNA聚合酶，故称为引物酶(primase)。大肠杆菌的引物酶又称为DnaG蛋白，是一条60KD的多肽链。引物酶在模板复制起始部位催化互补碱基聚合，形成短片段的RNA。•引发体DnaA、DnaB、dnaC蛋白，还有其他复制因子一起形成复合体，结合到模板DNA分子上，再结合引物酶(DnaG)，形成较大的聚合体，这种复合物称为引发体。引发体下游解开双链，再由引物酶催化引物合成。不同生物RNA引物及结构不同，动物细胞RNA引物约由10个核苷酸组成，第一个核苷酸常为ATP，原核生物RNA引物由数十个核苷酸组成，第一个核苷酸常为GTP。复制的起始⑴DNA拓扑异构酶Ⅱ在复制起始部位将DNA引入负超螺旋。⑵DnaA蛋白辨认、结合于起始位点的9mer处，并促使13mer局部解链。⑶DnaB与DnaC复合物进入，生成引发前体，然后DnaB继续发挥解链的作用。⑷SSB与解开的单链结合，稳定和保护单链。⑸引物酶(DnaG)进入并与引发前体结合生成引发体。⑹引发体中的引物酶催化NTP聚合，生成引物。⑺DNA拓扑异构酶(Ⅱ型为主)在解链前方理顺DNA链，松弛正超螺旋。DnaADnaB、DnaCDNA拓扑异构酶SSB3535引发体和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。理顺DNA链拓扑异构酶(gyrA,B)稳定已解开的单链单链DNA结合蛋白SSB催化RNA引物生成引物酶DnaG(dnaG)运送和协同DnaBDnaC(dnaC)解开DNA双链解螺旋酶DnaB(dnaB)辨认起始点DnaA(dnaA)蛋白质（基因）通用名功能原核生物复制起始的相关蛋白质•前导链(leadingstrand)：顺着解链方向连续复制的链。•后随链(laggingstrand)：与解链方向相反不连续复制的链。•冈崎片段(Okazakifragment):随从链上不连续复制的片段称为冈崎片段。5´5´555´3´3´3´领头链随从链解链方向复制方向与解链方向关系复制叉DNA的半不连续复制（三）冈崎片段与半不连续复制--链的延伸（四）复制的终止基因组中能独立进行复制的单位称为复制子(replicon)，每个复制子中含有一个复制起始点和一个复制终止点。原核生物染色体只有一个复制起始点，故有单一的复制子；•原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。oriCter100/03282oriCter猿猴病毒SV40复制的起点和终点180oE.coli复制的起点和终点双链环状、θ型复制、双向等速5´5´5´5´5´5´5´5´OHPpolⅠ5´→3´外切酶polⅠ5´→3´聚合酶dNTP连接酶ATPADP＋Pi不连续片段的连接DNA连接酶应用：⑴在复制中起最后接合缺口的作用。⑵在DNA修复、重组、剪接中也起缝和缺口的作用。⑶基因工程的重要工具酶之一。（五）原核生物的DNA聚合酶种类：大肠杆菌中存在DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ⑴DNA聚合酶活性：三种酶都有DNA聚合酶活性，且都需要模板和引物，但DNApolⅢ对底物的亲和力最高，聚合方向为5´→3´。⑵3´→5´外切酶活性：三种酶都有，但DNApolⅠ活性最强。这种酶活性是基于对不配对碱基造成的单链的识别，故对复制的保真性至关重要。DNApolⅠ利用3´→5´外切活性切除错配的碱基，同时利用5´→3´聚合活性补回正确的核苷酸，这种功能称为即时校读(proofread)。碱基配对正确，DNApolⅠ无活性3´-5´外切活性5´-3´聚合活性DNApolⅠAGdCTPCG5´3´5´3´DNApolⅠ的3´-5´外切与即时校读功能⑶5´→3´外切酶活性：DNApolⅠ有5´→3´外切酶活性，可切除引物。⑷三种聚合酶的分子结构：①DNApolⅠ为单一肽链，分子量103KD，由A-R共18个α-螺旋肽段组成。DNA-polⅠ经特异蛋白酶水解可产生大、小两个片断。小片段由323个氨基酸残基构成，具有5´→3´外切酶活性；大片段由604个氨基酸残基构成，分子量68KD，具有5´→3´聚合酶活性及3´→5´外切酶活性，是进行分子生物学研究常用的工具酶，大片段也称klenow片段(klenowfragment)。DNApolⅠ结构5´→3´外切酶活性3´→5´外切酶活性聚合酶活性NC小片段Klenow片断DNApolⅠ三个活性中心②DNApolⅡ由4个以上的亚基构成，分子量90KD。③DNApolⅢ分子量为900KD，全酶由10种(α、ε、θ、τ、γ、δ、δ´、β、κ、ψ)22个亚基构成不对称二聚体；核心酶包含α、ε、θ亚基；α亚基分别催化领头链与随从链的合成；ε亚基有3´→5´外切酶活性及对碱基的选择功能，θ亚基为装配所必需；β亚基起着夹住模板又能使酶延模板滑动的作用。A：E