分子生物学第四章

第四章分子生物学的研究方法一、重组DNA技术理论上三大发现技术上三大发明遗传物质是DNADNA双螺旋结构遗传信息传递方式工具酶载体转录酶1973年以DNA重组实验成功为标志现代分子生物学跨越天然物种屏障定向创造新物种工具酶基因载体受体细胞必要条件操作过程获得外源基因（目的基因/目的片段）与载体进行体外重组形成重组体（重组子）将重组体导入（转化/转导/转染）受体细胞细胞扩增和筛选含有重组体的受体细胞（宿主细胞/寄主细胞）培养含有重组体的细胞（阳性克隆）检测表达产物分、切、接、转、筛+检工具酶限制性内切酶连接酶修饰酶DNA聚合酶DNAPolymerase逆转录酶ReverseTranscriptaseT4多核苷酸酶T4PolymeraseKinase碱性磷酸酶Alkalinephosphatase活性定义限制酶的一个活性单位（1U），原则上是在50µl的反应液中，37℃的温度条件下，经过1小时反应，将1µgDNA完全分解所需要的酶量。特点①识别部位序列一般为4、5或6个核苷酸序列；②呈双重轴对称。限制性内切酶性质切断识别部位或其附近特定部位后，产生两种末端，即平齐末端和粘性末端（5’突出端和3’突出端）。PstICTGC↓AGGA↑CGTCEcoRI3’突出5’突出特殊的限制酶同裂酶isoschizomer指来源不同，但有相同识别序列的限制性内切酶。同尾酶isocaudamer指识别序列不同，但切割DNA后可以产生相同粘端的限制性内切酶。DNA连接酶可以催化单链DNA的连接吗？DNA连接酶可以催化缺少核苷酸的切口的连接吗？连接酶主要连接酶的功能特点最常用连接酶T4DNAlingaseE.coli.DNAlingase平齐末端双链DNA分子的连接功能有无匹配粘性末端双链DNA分子的连接功能有有辅助因子ATPNAD+载体和插入片段具有相同的粘性末端容易连接成环状的重组DNA分子可能出现问题：•载体自身环化，造成假阳性背景克隆；•插入片段可双向插入；•插入片段可多拷贝插入。当DNA片段两端为非同源的粘性末端可实现定向克隆，连接效率高，简捷粘性末端连接可在连接前，用碱性磷酸酶将载体DNA5’端去磷酸化，这样只有载体和插入片段之间才能发生连接；利用磷酸酶防止载体DNA的重新环化。质粒载体的定向克隆基因工程常用工具酶作用限制性内切酶识别DNA特定序列，切割DNA链DNA聚合酶I或大片段Klenowfragment1、切口平移制作标记DNA探针；2、合成cDNA第二条链；3、填补双链DNA3’凹端；4、DNA序列分析DNA连接酶连接两个DNA分子或片断TaqDNA聚合酶聚合酶链式反应（PCR）逆转录酶合成cDNA第一条链T4多核苷酸激酶催化多核苷酸5’羟基末端磷酸化，制备末端标记探针末端转移酶在3’末端加入同质多聚物尾S1核酸酶、绿豆核酸酶降解单链DNA或RNA，使双链DNA突出段变为平端DNA端酶I降解DNA，在双链DNA上产生随机缺口RNA酶A降解除RNA磷酸酶切除核酸末端磷酸基E.coli.DNA聚合酶IE.coli.DNA聚合酶I大片段（Klenowfragment）T4噬菌体DNA聚合酶T7噬菌体DNA聚合酶耐高温DNA聚合酶：TaqDNA聚合酶DNAPolymeraseReverseTranscriptaseAlkalinephosphataseT4PolymeraseKinase细菌碱性磷酸酶BAP牛小肠碱性磷酸酶CIP修饰酶载体(vector)是能够携带外源DNA进入宿主细胞进行扩增和表达的DNA,它们一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建而成的。载体质粒噬菌体病毒组合载体种类能在宿主细胞中独立复制;具有多种限制酶的单一切点（多克隆位点）以便外源DNA插入；具有筛选标记,以区别阳性与阴性重组分子;分子较小，便于体外基因操作，同时载体DNA与宿主DNA便于分离；表达载体:具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件。必要条件具备条件分类克隆载体：以繁殖DNA为目的的载体，通常分子较小，自我复制能力强，拷贝数高。如pBR322、pUC、M13等。穿梭载体：带有两种复制原点，在原核细胞和真核细胞中都能繁殖的载体，通常用于真核基因的克隆。表达载体：以获得基因表达产物为目的的载体，通常要具有强启动子、结构稳定、拷贝数高和能在宿主细胞中高效表达等特点。克隆载体的特性•复制起始：在受体细胞中独立复制•多克隆位点：含多个限制性核酸内切酶单一切点•多选择标记：抗药性，其他遗传标记•分子量小：能容纳的外源DNA片段尽可能大常用克隆载体质粒λ噬菌体CosmidPhagemid真核病毒YAC,BAC分类松弛型*－独立复制，拷贝数高,10-200个拷贝/细胞，例如pUC载体可达700个/细胞严紧型－受受体染色体DNA复制控制，拷贝数低，1-几个拷贝/细胞，例如pSC101天然型人工型*可转移型不可转移型*氯霉素扩增－氯霉素可抑制染色体DNA复制，但质粒复制不受影响，可增加拷贝数。1、什么是质粒?2、质粒作为基因工程载体的原因?3、质粒的分类?基因工程使用的质粒的特点?兼容型非兼容型*克隆载体pUC19质粒图谱克隆载体pBR322质粒图谱