分子生物学课件chapter4DNA复制

Chapter4TheReplicationofDNAChapter8ofthebookIntroductionWhenwilltheDNAreplicationhappen?DNA复制在细胞周期的S期E.coli37℃0.5h105bp/minmammaliancell500-5000bp/min（4）细菌(E.coli)DNA每个细胞周期只复制一次1、Semi-ConservativeReplication1958Meselson-stahl设计的CsCl超离心试验证实了DNA复制的这一特性概念：复制过程中各以双螺旋DNA的其中一条链为模板合成其互补链，新生的互补链与母链构成子代DNA分子15N标记实验·细胞生长在15N标记培养基中·转入正常N源培养基中·分离各代DNA·分析各代DNA的浮力密度15N标记DNACsCL密度梯度离心浮力密度N15－DNA1.742g/mlN15－N14－DNA1.717g/mlN14－DNA1.710g/ml聚合反应：substrate－－dNTPPoly(核苷酸)n－3’-OH＋dNTP→Poly(核苷酸)n+1－3’-OH＋2PiThedirectionofreplicationCorrectlypairedbasesarerequiredforDNA-polymerase-catalyzednucleotideaddition子链DNA延伸方向只能是5’－3’5’OHTCATCAC5’OH3’pppOHC++ppi如果DNA的延伸方向是3’→5’ATCG+5’pppOH3’GpppOHGATCG5’pppOH3’ATCG+5’pppOH3’GpppOHG5’pppa、因能量的需要，DNA的5’端必须带有PPP游离dNTP具有ppppppOH3’ATCG在0.2MNacl的生理环境中，使dNTP难以聚合到DNA的5’端需要其他机制以解脱TheinitiationofanewstrandofDNArequiresanRNAprimer(primase)DNAhelicasesunwindthedoublehelixinadvanceofthereplicationforkSingle-strandedDNA-bindingproteinsstabilizessDNApriortoreplicationTopoisomerasesremovesupercoilsproducedbyDNAunwindingatthereplicationforkDNApolymeraseextendtheDNAchainTable8-1(factorsinvolvedinthereplication)1)、解螺旋酶（helicase）:又称解旋酶,通过水解ATP获得能量,解开DNA双链.2).单链结合蛋白（SSB):结合在DNA单链上,有时有协同效应.3)、DNA旋转酶：消除复制叉前进过程中产生的正超螺旋，产生负超螺旋.TheinitiationofDNAreplication（1）OriCinE.colichromosomalDNA♦四个9bp的重复序列dnaA结合位点♦三个13bp的重复序列若干GATC位点酵母菌的复制起点称为ARS(autonomouslyreplicatingsequence)，有100多个bp。ARS包括一个共有序列(A)和附加元件(B1~B3)。A功能域为ARS的中心，可能是起始蛋白的结合位点。A的序列为(T/A)AAATA(T/C)AAA(T/A)；A元件在芽殖酵母中高度保守，是复制起始所必需的。其中有富含AT的11bp序列是复制起始识别复合物（originrecognitioncomplex,ORC）结合复制起始位点所必需的，对起始因子在复制起始位点的组装起基本作用。Replicationfork真核生物（Eukaryote）:多复制起点即－－一个genome中有多个复制单位TheinitiationofDNAreplicationDnaAistheinitiatorprimaseanRNAenzymeinvolvedinthereplicationofDNA.PrimasecatalyzesthesynthesisofashortRNAsegment(calledaprimer)complementarytoassDNAtemplate.noknownDNApolymerasescaninitiatethesynthesisofaDNAstrandwithoutaninitialRNAorDNAprimer引发体（包括引发酶）pppRNA引物DNApolymeraseIIIpppDNApolymeraseIDNApolymeraseIDNAligaseDNALigase所需条件：a、切刻的3’－OH和5’－P相邻b、切刻各自碱基处于配对状态c、需要能量原核（ATP、NAD）真核（ATP）用途：复制过程中，5’端RNA引物被置换后切刻的连接修复、重组DNApolymerase三种DNA聚合酶的结构和功能3’－5’exonucleaseactivity（polymeraseI,II,III）校对功能(proofreading)5’－3’exonucleaseactivity(polymeraseI,III)DNApolⅠ的5’－3’外切活性有以下三个特点：♦必须有5’－磷酸末端♦被除去的核苷酸必须是已经配对的♦被除去的可以是脱氧核糖核苷酸，也可以是核糖核苷酸（切刻平移）其中DNApolⅢ全酶有十种共22个亚基β二聚体－－滑动钳InteractionbetweenDNAandDNApolymeraseTheinitiationofDNAsynthesisinE.coli2、真核生物的DNA聚合酶α、β、δ、ε、γ五种位置核内核内核内核内线粒体合成与引发修复合成合成,修复复制功能酶结合前导链后随链3’－5’校NONOYesYesYes正活性αβδεγActivationofthepre-RCleadstotheassemblyoftheeukaryoticreplicationforkTheactivationofpre-RCsistightlyregulatedbycyclin-dependentkinases(Cdks)（3）复制终止a、终止序列E.coli有两个终止区域，分别结合专一性的终止蛋白序列一：terEterDterA序列二：terFterBterC每个区域只对一个方向的复制叉起作用b、专一性终止蛋白E.coli中由tusgene编码（terminusutilizationsubstance）通过抑制DNA螺旋酶而发挥终止作用每次复制时只使用一个终止位点ter5、复制忠实性的保证1、DNApol的3’5’外切酶活性(exonucleaseactivity)2、DNApol只能从引物的3’端延伸DNA（需要RNA引物）a、碱基配对协同性导致最初几个碱基错配率高，且不易校正b、RNA引物最终被降解而避免错误3、后随链的不连续合成因其有利于错配碱基的校正3.6.真核生物DNA的复制(DNAreplicationinEukaryote)3.真核生物DNA复制的引发酶●DNApolα+primase形成紧密的复合物6-9NtRNAasprimer●引发酶（primase）：50-60kd●作用方式为阵发性的，每次作用拷贝6～15个核苷酸●既能利用NTP，又能利用dNTP●SV40体外DNA复制情况分析端粒位于真核生物染色体DNA的3’末端，由独特的DNA重复序列及相关蛋白组成的复合体。端粒的功能：①维持染色体的完整性，决定细胞的寿命。若无端粒，两个染色体末端很可能融合一起。②解决末端复制问题，端粒酶能与端粒作用，延伸其长度。端粒的结构①DNA端粒由简单的串联重复序列组成人和其他脊椎动物：AGGGTT纤毛原生动物四膜虫：GGGGTT和GGGGTTTT面包酵母：G1－3T和G1－5A共同特点：富含G；长度达几百到几kb；人类DNA端粒长几kb到几十kb。端粒酶(Telomerase)是催化端粒合成的酶。它是由一条RNA和多种蛋白质构成的核糖核蛋白复合体。端粒酶中的蛋白部份具有逆转录酶活性，能以其自身携带的RNA为模板逆转录合成端粒DNA。端粒酶的作用机制：端粒酶的RNA分子与端粒DNA配对，以RNA为模板进行类似逆转录合成DNA，向5’→3’延伸端粒至模板RNA末端后，延长的DNA末端与RNA模板解离，端粒酶移动，重新定位于延长后的DNA3’端，开始下一轮延长过程，如此反复可达数百次合成几百个或数千个重复序列。（3）补齐过程通过TG链的回折形成发夹结构（G·G氢键）－－－尺蠖模型→→实现端粒酶位置的调整大多数体细胞不合成端粒酶，每次分裂后端粒就变短（约30～200bp）。当端粒比正常的长度短数kb时细胞就不再分裂。所以端粒变短是一种老化的象征。实验证明将端粒酶加进体细胞，可以增加体细胞分裂次数。癌细胞主要特性是能无限期的分裂增生，这需要不断表达端粒酶。实验发现癌细胞的端粒酶活性很强。这点可被用来检验癌细胞。实验表明－－人体细胞通过监测失去的端粒的重复数而计数细胞分裂次数，当端粒长度下降到某一临界值时，细胞终止分裂－－－衰老、死亡“多莉”的衰老研究端粒丢失的速率，预测人类的寿命＞XXXYwhy?研究推测端粒酶与肿瘤的关系ColE1质粒DNA的复制是从一个特定的复制起点（ori）开始，并沿着环DNA分子单向性地进行。控制此种质粒DNA复制启动的两种关键因素RNAI和RNAⅡ两种RNA分子，都是由ColE1DNA转录产生的。其中RNAⅡ也叫做复制引物。RNAⅡ分子在转录起点附近同互补的模板DNA形成一种杂交分子，被RnaseH酶所切割，从而释放出3′-OH末端，作为供DNA聚合酶Ⅰ合成DNA的引物。RNAⅠ可以通过同RNAⅡ结合，以阻止其与模板DNA发生杂交作用。原核细胞DNA复制的调控真核生物的复制起始受许可因子的控制a、复制子的大小（Sizesofreplicon）:Yeastorfly平均40kbMammals平均100kbProkaryoticDNA:1000kbb、冈崎片段(Okazakifragments):ProkaryoticDNA:1000-2000ntEukaryoticDNA:100-200ntc、复制速度（Rateofreplication）:EukaryoticDNA:ca.3,000bp/min(50/sec)ProkaryoticDNA:50,000bp/min(900/sec)原核生物和真核生物DNA复制的比较