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动物细胞培养动物细胞融合单克隆抗体制备动物细胞核移植常用技术手段（基础）一、动物细胞培养动物细胞培养就是从动物机体内取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。1、概念：原理：细胞增殖动物胚胎或幼龄动物的组织、器官细胞悬液10代细胞50代细胞传代培养无限传代单个细胞加培养液原代培养胰蛋白酶或胶原蛋白酶剪碎动物组织细胞间隙中含有一定量蛋白质2、过程动物细胞培养适宜的PH为7.2—7.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。3、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？1、动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因？不能，因为动物细胞培养适宜的PH为7.2—7.4，此环境下胃蛋白酶没有活性。胚胎组织或幼龄动物的组织或器官生命力旺盛，分裂能力强探究2、如何将动物组织分散成单个的细胞呢？先用剪刀剪碎,后用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理4.什么叫细胞贴壁？5.什么叫接触抑制？悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。探究6、如何理解原代培养和传代培养？8、传代培养的细胞都能一直传代下去吗？9、有些为何能一直传下去？上述过程中，在第一培养瓶中培养就是原代培养，之后转移到其它培养瓶中培养就是传代培养遗传物质发生改变，朝着癌细胞方向发展不都能单个细胞传至十代左右（分装前的细胞培养）将原代细胞从培养瓶中取出，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养。10到50代的细胞，遗传物质没发生改变。超过50代的细胞，遗传物质发生改变，可无限增殖。有关概念细胞贴壁:接触抑制:悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，就会停止分裂增殖，称为接触抑制。原代培养：传代培养：细胞株：细胞系：补充细胞悬浮液10代细胞50代细胞无限传代原代培养传代培养细胞株细胞系如何界定原代培养和传代培养；细胞株和细胞系？动物胚胎或幼龄动物的组织、器官细胞悬液10代细胞50代细胞无限传代原代培养传代培养细胞株细胞系剪碎胰蛋白酶处理胰蛋白酶除了可消化细胞间的蛋白质外，长时间作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，因此必须控制好胰蛋白酶的消化时间。细胞贴壁、接触抑制培养液培养一般而言，10代以内能保持正常二倍体的核型增殖会逐渐缓慢，以至于完全停止，这时部分细胞的细胞核可能会发生变化，2、过程1、无菌、无毒2、营养（培养基成分）3、适宜的温度和PH值4、必要的气体条件（糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、血清、血浆等。）O2和CO23、条件：添加一定量的抗生素定期更换培养液培养液和培养器具无菌处理培养基的不同是动物细胞培养和植物组织培养最重要的区别36.5+0.5度PH为7.2-7.4CO2的主要作用是维持培养液的PH4、应用•大规模培养生产生物制品（病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体）•基因工程的受体细胞•培养的动物细胞可以用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性•用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据细胞的全能性细胞株、细胞系植株培养结果获得细胞或细胞产物快速繁殖、培育无病毒植株等培养目的动物血清植物激素培养基特有成分液体培养基固体培养基培养基性质细胞增殖原理动物细胞培养植物组织培养比较项目植物细胞和动物细胞培养的比较二、动物细胞核移植技术和克隆动物1.动物细胞核移植的概念、种类：2.体细胞核移植的过程：3.体细胞核移植技术的应用前景：4.体细胞核移植技术存在的问题：将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体（克隆动物）分类胚胎细胞核移植：体细胞核移植：细胞分化程度低，恢复全能性容易细胞分化程度高，恢复全能性不容易概念：1.动物细胞核移植的概念、种类：例：克隆羊黑面绵羊去核卵细胞白面绵羊乳腺细胞核细胞核移植重组细胞电脉冲刺激早期胚胎胚胎移植另一头绵羊的子宫妊娠、出生克隆羊多利2.体细胞核移植的过程：卵细胞Ａ母绵羊Ｂ母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植早期胚胎卵裂C母绵羊子宫胚胎移植多莉羊分娩妊娠多莉羊的培育过程融合后的卵细胞核移植技术①加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育②保护濒危物种，增加存活数量③克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白④可以作为异种移植的供体⑤可以用于组织器官的移植3.体细胞核移植技术的应用前景：4.体细胞核移植技术存在的问题：•①成功率低•②克隆动物存在健康问题•③克隆动物食品的安全性问题存有争议思考题１、核在进行体细胞核移植之前，为何要去掉受体卵母细胞的核？为使核移植动物的遗传物质全部来自有利用价值的动物提供的细胞。２、用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，为什么？10代以内的细胞保持一般保持正常二倍体的核型，未突变3、细胞核移植生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？不是，克隆动物绝大部分DNA来自供体细胞核，但核外还有少部分DNA（如线粒体DNA）来自受体卵母细胞