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专题二细胞工程细胞工程概念原理和方法、操作水平、目的、分类指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过细胞水平或细胞器水平上的操作，按照人的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。根据操作对象不同，可分为植物细胞工程和动物细胞工程两大领域。细胞全能性•1、概念•2、为什么已经分化的细胞依然具有全能性？•3、在生物发育过程中，为什么细胞没有表现出全能性，而是分化成各种组织和器官？•4、细胞全能性大小比较细胞全能性大小比较①受精卵胚胎干细胞生殖细胞体细胞②体细胞：植物细胞动物细胞③分化程度低的细胞分化程度高的细胞④分裂能力强的细胞分裂能力弱的细胞⑤随着细胞分化的程度不断提高，细胞的全能性逐渐减小。即时应用有关细胞全能性的叙述，不正确的是（）A.受精卵在自然条件下能使后代细胞形成完整个体，因此其全能性最高B.生物体内细胞由于进行分化，全能性不能表达C.卵细胞与受精卵一样，细胞未分化，全能性很高D.在一定条件下，植物细胞离体培养能表现出全能性C动物细胞工程•1、常用技术手段•2、基础技术•3、应用动物细胞工程通常采用的技术手段动物细胞融合单克隆抗体动物细胞核移植是其他动物细胞工程技术的基础。动物细胞培养资料：烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人？取该患者的皮肤进行细胞培养,获得足量的细胞后再移植。一、动物细胞培养的概念就是从动物机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖。想一想：动物细胞培养的基本原理是什么？原理：细胞增殖（有丝分裂）二、动物细胞培养的操作过程思考1、选取什么样的组织材料？动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织2、为什么选用上述组织材料？增殖能力强，分化程度低，更容易培养思考3、为什么将组织材料分散成单个细胞？4、如何将组织分散成单个细胞？剪碎，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理一段时间用胰蛋白酶处理，组织就会分散成单个细胞，说明？说明细胞与细胞间的主要物质是蛋白质胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白外，长时间的作用也会消化细胞膜蛋白，因此必须控制好胰蛋白酶的处理时间。5、动物细胞培养中的两个显著特点：细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。细胞的接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。细胞贴壁过程细胞的接触抑制接触抑制单层细胞思考6、什么是原代培养？什么是传代培养？原代培养与传代培养的分界点？分瓶的继续培养胰蛋白酶使用几次？两次7、传代培养的三个阶段①、10代以内：容易传代，传代细胞正常的二倍体核型不会改变。核型（染色体组型）：一个细胞内所有染色体的大小、形状和数量特性的汇总。②、10-50代左右时：细胞增殖缓慢，以至于完全停止，此时部分细胞的细胞核型可能会发生变化。③、50代之后：如果继续传代培养，少部分细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性，这些细胞已经发生了突变，正在朝着等同于癌细胞的方向发展。遗传物质改变——细胞系接触抑制50代以后失去接触抑制细胞膜表面糖蛋白减少，细胞黏着性降低。8、人们一般保存的是哪类细胞？为什么？思考9、动物细胞培养的结果？获得细胞群是否体现出细胞的全能性？没有二、动物细胞培养的操作过程分离组织（幼龄动物）分散细胞（胰蛋白酶）原代培养（细胞增殖）传代培养（细胞增殖）分装（胰蛋白酶）三、动物细胞培养条件能否用胃蛋白酶代替胰蛋白酶？1、无菌、无毒的环境对培养液和培养用具进行无菌处理；在培养液中添加一定量的抗生素;定期更换培养液；2、营养葡萄糖、氨基酸、无机盐、促生长因子、微量元素等动物血清、血浆3、温度和pH温度36.5±0.5度，pH7.2～7.44、气体环境培养皿或松盖培养瓶，O2和CO2（95%空气和5%CO2）O2是细胞代谢所必需的。CO2维持培养液的pH。合成培养基、液体培养；回顾•1、动物细胞培养概念、原理•2、动物细胞培养过程细胞贴壁、细胞接触抑制、原代培养、传代培养•3、动物细胞培养条件四、动物细胞培养技术的应用1、生产生物制品病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等；3、用于检测有毒物质及毒性；2、动物基因工程离不开动物细胞的培养；4、培养正常或各种病变的细胞，用于生理、病理、药理等方面的研究。阅读P46-47总结动物细胞培养与植物组织培养的比较学习指导第31页资料：为什么体外培养的动物细胞会贴壁？贴附是有机体细胞在体内生存和生长发育的基本方式，包括细胞与细胞之间的相互接触和细胞与细胞外基质之间的相互接触两种方式。正是基于细胞的这种贴附生长的特征，使得不同细胞之间结合而形成组织，也使细胞与周围环境之间保持联系。因而有机体的绝大多数细胞必须贴附在某一固相支持物上才能生长增殖。体外培养时多数细胞仍然保持了这种特性，即必须贴附在培养瓶壁等支持物上才能生长增殖。资料：为什么贴壁的细胞会接触抑制？细胞膜上有糖类和蛋白质共同构成的糖蛋白,也叫做糖被,他在细胞上起识别作用.当细胞增殖到一定程度,也就是互相挨在一起的时候,糖蛋白识别了这种信息,就会使细胞停止继续繁殖,这种现象就叫做接触抑制.在相同条件下培养的癌细胞，由于没有糖被，对密度依赖性生长抑制失去敏感性，因而不会在形成单层时停止生长，而是相互堆积形成多层生长的聚集体,这种现象也说明恶性细胞的生长和分裂已经失去了控制，调节细胞正常生长和分裂的信号对于恶性细胞不再起作用。人工关节——软骨再生1.第一次手术:从病人关节软骨中未受损的部分，取出一片约为葡萄干大小的健康软骨组织。2.分离软骨细胞并经三星期的体外培养，使细胞数增加约10～20倍。3.第二次手术:清理软骨受损的部分，从下方骨头部位取出一片约与伤口大小相同的骨膜，缝在伤口上方，再将软骨细胞注射到骨膜下方。资料三：结果:经过复健一年后即可恢复正常的生活。自体皮肤移植二、动物体细胞核移植技术和克隆动物克隆就是无性繁殖，具体地说，是指一个共同的祖先，通过无性繁殖的方法产生出来的一群遗传特性相同的DNA分子、细胞或个体。a.分子水平上：b.细胞水平上：c.个体水平上：1.什么是克隆？一般指DNA克隆。指一个单一的细胞分裂所形成的细胞群体。指基因型完全相同的两个或一个群体。2、克隆动物能否用类似植物组织培养的方法获得？为什么？目前不能。因为动物细胞的全能性随着分化程度的提高逐渐受到限制,分化潜能逐渐变弱。目前，用动物体细胞克隆的动物，实际上是通过核移植来实现的。胚胎移植细胞核移植动物细胞培养体积大，易操作，而且含有促使细胞核全能性表达的物质和营养条件。操作简便，损伤较小体现出细胞膜具有一定的流动性1432１、在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？为使核移植动物的核遗传物质全部来自有利用价值的动物提供的细胞。２、用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，为什么？10代以内的细胞一般保持正常二倍体的核型，从而保证供体细胞正常遗传基础。讨论：讨论：3、体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？克隆动物绝大部分DNA来自供体细胞核，但核外还有少部分DNA（如线粒体DNA）来自受体卵母细胞。不是性状是基因与环境共同作用的结果。克隆动物生活的环境与供核动物生活的环境不会完全相同，其性状也不可能和供核动物完全相同。动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体。（克隆动物）动物核移植胚胎细胞核移植体细胞核移植细胞分化程度低，恢复全能性容易细胞分化程度高，恢复全能性困难（三）体细胞核移植技术的应用前景阅读P49-501、畜牧业方面：2、医药卫生方面：可以加速家畜遗传改良的进程，促进优良畜群繁育。保护濒危物种，增加其存活数量生产医用蛋白质组织器官的移植3、其他领域了解胚胎发育及衰老过程更好追踪研究疾病的发展过程、治疗疾病（四）体细胞核移植技术存在的问题1、成功率低2、克隆动物存在健康问题3、对克隆动物食品安全问题也存有争议供体细胞（供核）细胞培养体细胞卵巢卵母细胞（MⅡ中期：供质）去核无核卵母细胞注入细胞融合重组细胞构建重组胚胎胚胎移植代孕母体生出与供体奶牛遗传基本相同的犊牛发育动物体细胞核移植技术和克隆动物1、概念2、原理3、种类4、过程（重难点）5、应用6、存在问题为什么“将供体细胞注入去核卵母细胞”而不是“将供体细胞的细胞核注入去核卵母细胞”？体细胞核移植技术最初是用玻璃微型吸管将供体细胞的细胞核吸出，再注入到去核卵母细胞内，后来发展出了另外一种方法，即直接将供体细胞注入到去核卵母细胞透明质内，然后用病毒介导或者电脉冲等方式使两个细胞融合，因为这种方法操作简便，对卵母细胞损伤较小，现在较为常用，多莉羊的产生就是用的这种方法.如注入的是供体细胞，为什么叫“核移植技术”？因为供体细胞的细胞核拥有完整的遗传信息，对后代的性状表达起决定性的作用，线粒体DNA编码的基因很少，表达的蛋白主要存在于线粒体中，与线粒体自身氧化磷酸化产生能量的功能相关，与后代的性状表达并没有很大的关系。供体细胞的细胞质中的遗传物质是否也能表达出相应性状？核移植后的细胞质中同时存在供体细胞和受体细胞的线粒体，到底这些线粒体是可以共存，还是一种消失一种保留，这个还处于研究阶段。