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所采用技术的理论基础植物细胞工程通常采用的技术手段植物组织培养植物体细胞杂交植物细胞的全能性动物细胞工程：1.动物细胞培养2.动物细胞融合3.单克隆抗体4.胚胎移植5.核移植动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。一、动物细胞培养怎样进行动物细胞的培养？（1）、动物细胞培养液的主要成分是什么？（2）、动物细胞培养液与植物组织培养基相比有何独特之处？（3）、为什么选用幼龄动物胚胎或其组织、器官做动物细胞培养材料？（4）、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？（5）、为什么要选用胰蛋白酶分散细胞？（6）、如何界定原代培养和传代培养、细胞株和细胞系？（7）、动物细胞培养能否像植物组织细胞培养那样，最终培养成生物个体？1、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。动物细胞培养液的主要成分：与植物培养基相比独特之处：（1）液体培养基（2）含有动物血清动物体细胞大都生活在液体的环境为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中蛋白质主要为白蛋白和球蛋白。其中有些氨基酸动物本身不能合成，必须由培养液提供。血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生长因子（如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、类胰岛素生长因子等）血清还含有多种未知的促细胞生长因子、促帖附因子及其他活性物质，能促进细胞的生长、增殖和贴附。因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需添加10%~20%的血清。2、为什么选用幼龄动物胚胎或其组织、器官做动物细胞培养材料？因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强3、为什么细胞培养要分散成单个细胞培养？分散成单个细胞、细胞群（团）后容易培养，细胞所需的营养容易供应，代谢废物容易排除；而用大块组织培养时，内部细胞的营养供应和代谢废物的排除都较困难，因此，这些细胞在体外长时间的生存和生长较困难。4、为什么要选用胰蛋白酶分散细胞？用胃蛋白酶行吗？进行动物细胞培养时，用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。动物细胞培养适宜的PH为7.2—7.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高5、如何界定原代培养和传代培养、细胞株和细胞系？胚胎或幼龄动物的组织器官单个细胞细胞悬浮液细胞株细胞株剪碎加培养液制成传代培养胰蛋白酶或胶原蛋白原代培养传代培养原代细胞细胞系细胞悬浮液10代细胞50代细胞无限传代原代培养传代培养细胞株细胞系多数组织细胞固定在表面生长和分裂。随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40~50代，这种传代细胞为细胞株。细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。6、动物细胞培养能否像植物组织细胞培养那样，最终培养成生物个体？不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体获得细胞细胞的全能性细胞株、细胞系植物体培养结果或细胞产物快速繁殖、培育无病毒植株等培养目的葡萄糖、动物血清蔗糖、植物激素培养基特有成分液体培养基固体培养基培养基性质细胞增殖原理动物细胞培养植物组织培养比较项目7、植物细胞和动物细胞培养的比较动物细胞培养应用大规模培养生产生物制品（病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体）获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮培养的动物细胞可以用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据二、动物细胞融合细胞核病毒颗粒细胞核灭活的病毒颗粒黏附在细胞表面细胞膜被病毒颗粒穿过细胞膜连接二、动物细胞融合细胞融合，形成杂种细胞细胞融合方法化学：PEG（聚乙二醇）物理：电融合生物：灭活的病毒（仙台病毒）仙台病毒紫外线丧失感染性（不感染细胞）保留融合活性（诱导细胞融合）主要用于制备单克隆抗体获得杂种植株用途物理、化学方法（同左）灭活的病毒物理（离心、振荡、电刺激）化学（聚乙二醇）诱导方法使细胞分散后诱导细胞融合去除细胞壁后诱导原生质体融合细胞融合的方法细胞膜的流动性细胞膜的流动性、植物细胞全能性原理动物细胞融合植物体细胞杂交比较项目植物、动物细胞融合的比较三、单克隆抗体读下面一段文字资料，思考以下问题：长期以来，为了获得抗体，采用的是把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需抗体的方法。用这种方法获得的抗体，不仅产量低，而且抗体的特异性差，纯度低，反应不够灵敏。人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的B细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每个B细胞只分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体。要想获得大量的单一抗体，必须用单个B细胞进行无性繁殖，即克隆。什么是抗体？由何种细胞产生？主要分布在哪里？起何作用？什么是单克隆抗体？效应B细胞血清特异性免疫作用抗体：机体受抗原刺激后产生的，并且能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。用单个B淋巴细胞进行无性增殖（扩增），也就是通过克隆，形成细胞群，这样的细胞群就有可能产生出化学性质单一、特异性强的抗体——单克隆抗体单克隆抗体讨论：怎样才能获得单克隆抗体？提示1：仅用细胞培养技术可行吗？提示2：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？提示3：有什么方法能使B细胞产生抗体的能力和肿瘤细胞无限增殖能力同时具备呢？设计方案：一个B淋巴细胞－－只分泌一种特异性抗体小鼠骨髓瘤细胞－－能无限增殖-化学性质单一、特异性强的抗体。杂种细胞单克隆抗体单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程注射抗原B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选杂交瘤细胞细胞培养筛选，继续培养足够数量的、能产生特定抗体的细胞群体外培养注射到小鼠腹腔单克隆抗体诱导其融合的方法有哪些？两次筛选分别有什么目的？本过程利用了哪些原理？为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？思考：1、本过程利用了哪些原理？免疫原理细胞融合原理动物细胞培养原理2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合?小鼠骨髓瘤细胞可以在体外培养条件下大量增殖，B淋巴细胞能够产生抗体，这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体,细胞的同源性越近，融合形成的杂种细胞越易成活。3、骨髓瘤细胞是癌细胞吗?有无限增殖能力的细胞是肿瘤细胞，具有转移能力的肿瘤细胞，称为癌细胞，所以说，瘤细胞不能等于癌细胞。4、整个制备过程为何要经过两次筛选?第一次筛选得到杂交瘤细胞（多种）第二次需先在多孔培养板上，在每孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始培养，然后再筛选出能产生特异性抗体的细胞群。由于该细胞群是单个杂交瘤细胞克隆得来的，所以产生的抗体必然是化学性质单一的，特异性强的单克隆抗体。这里的单克隆确有单个细胞克隆的含义，只不过克隆的不是B淋巴细胞，而是杂交瘤细胞。单克隆抗体的应用与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，灵敏度高，优越性十分明显。应用主要有：1、临床诊断2、作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”治疗肿瘤资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。卵细胞Ａ母绵羊Ｂ母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植早期胚胎卵裂C母绵羊子宫胚胎移植多莉羊分娩妊娠多莉羊的培育过程融合后的卵细胞四、动物克隆克隆动物的研究意义1.用于生物学和医学研究的实验动物2.改良动物品种3.治疗人类疾病4..保护濒危动物五、胚胎移植技术试管动物（婴儿）培养过程卵细胞精子体外受精受精卵胚胎新个体母体子宫内孕育、产出小结两个过程动物细胞培养过程单克隆抗体制备过程三个“一”一个诱导细胞融合的新方法－－灭活病毒一个新细胞－－杂交瘤细胞一个优势－－单克隆抗体特异性强、灵敏度高的优势下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的抗体实验方案3、图中B为________过程，常用_________作为诱导剂，该细胞继承___________的遗传特性，既能__________,又能___________。1、该实验方案的目的是__________2、A是从小鼠的脾脏中取得_______,该细胞能够产生______4、C过程指细胞培养，该过程包括_____培养和_____培养两个阶段，其中_____代以内的的细胞属于细胞株。制备单克隆抗体B细胞抗体细胞融合灭活病毒双亲细胞分泌抗体无限增殖原代传代50B体外培养骨髓瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群注射到小鼠腹腔AC练一练