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第九章发酵工程下游技术概论一、下游加工过程在生物技术中的地位下游技术（工程）（downstreamprocessing）：对于由生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术。下游加工过程的重要性。（组成、费用和关注程度）①组成：下游加工过程是生物技术的重要组成部分，发酵液或反应液需要经过下游加工过程才能成为成品；②费用：传统发酵工业中下游部分的费用占整个工厂投资费用的６０％，而对重组ＤＮＡ生产蛋白质等基因工程产品，下游加工的费用可占整个生产费用的８０％－９０％；③关注程度：英国政府工业部于１９８３年发起生物分离计划（ＢＩＯＳＥＰ），专门研究下游加工过程；１９８７年英国化学工业会召开了专门讨论下游加工过程的国际会议；我国也于１９８９年在济南召开了一次专门会议；近十年来国内外有关生物分离或蛋白质纯化的专著陆续出版。二、下游加工过程的特点含水多，产物含量低；含菌体蛋白；溶有原来培养基成分；相当多的副产物和色素；易被杂菌污染或使产物进一步分解；易起泡，粘性物质多。1.发酵液的特点2.整个下游加工过程应遵循下列四个原则1)时间短；2)温度低；3)pH适中（选择在生物物质的温度范围内）；4)严格清洗消毒（包括厂房、设备及管路，注意死角），这和传统产品抗生素的生产是一致的。对基因工程产品还应注意生物安全（biosafety）问题，要防止菌体扩散，一般要求在密封的环境下操作。三、生物工业下游技术的发展历程1.古代酿造业2.第一代生物技术古代酿造业包括酿酒、制酱（油）、醋、酸奶和干酪等。技术原始、家庭式作坊、产物基本不经过后处理而直接使用，无下游技术。主要指19世纪60年代---20世纪40年代青霉素等抗生素出现之前的生物技术产业。发现了发酵的本质是微生物的作用，掌握了纯种培养技术，生物技术进入近代酿造产业的发展阶段。到20世纪上半叶，逐渐开发形成了发酵法生产酒精、丙酮、丁醇等微生物发酵工业（厌氧发酵），其产品相对简单，基本上是无活性的小分子。此时开始引入过滤、蒸馏、精馏等近代分离技术。以20世纪40年代出现的青霉素产品为代表。无菌空气制备技术、大型好氧发酵装置开发，一大批通风发酵技术产品相继投入了工业生产，如抗生素（链霉素）、氨基酸（谷氨酸）、有机酸（核酸、柠檬酸）、酶制剂（淀粉酶）、微生物多糖和单细胞蛋白等。产品多样性决定了分离方法的多样性。借鉴和引进吸收了大量的近代化学工业的分离技术，如沉淀、离子交换、萃取、结晶等。3.第二代生物技术以20世纪70年代末崛起的DNA重组技术及细胞融合技术为代表。生物技术在其主要领域：基因工程、酶工程、细胞工程和微生物发酵工程取得了长足进步，一批高附加值的产品开始面世，如乙肝疫苗、干扰素等。80年代，发现了一大批生理功能性物质，如活性糖质、活性肽、高度不饱和脂肪酸等，生物技术在深度和广度上都取得了很大的进展。1988年，日本由40多家公司组建高度分离系统技术研究联合体，瑞典的Pharmacia，Alfa-Laval等组建了Biolink公司，加强在生物工业下游技术领域的研究开发力量，不断推出新技术、新产品、新装备，以抢占更多的市场。新技术有超临界CO2萃取技术、膜过滤、渗透蒸发技术、各种色谱（层析）技术等。4.第三代生物技术20世纪80年代以来，生物工业下游技术进步很快，出现了很多新概念、新技术、新产品和新装备。大致可分为以下几大类：（1）固液分离技术（2）细胞破碎技术（3）初步分离纯化技术（4）高度分离纯化技术（5）其他新型分离技术近20年来，将在污水处理、化学工程和选矿工程上广泛使用的絮凝技术引入到发酵液的预处理上，研究开发了菌体及悬浮物絮凝技术，改善了发酵液的分离性能，加之纤维素助滤剂的开发，大大提高了发酵液的固液分离效率。在固液分离机械方面，也出现了一些性能优良的新型机械，如带式过滤机、连续半连续板框过滤机、螺旋沉降式离心机等。微滤膜可高效分离细微的悬浮粒子。（1）固液分离技术（2）细胞破碎技术（3）初步分离纯化技术（4）高度分离纯化技术（5）其他新型分离技术已开发出球磨破碎、压力释放破碎、冷冻加压释放破碎和化学破碎等技术。该技术的成熟使得胞内生物物质的大规模工业化生产成为可能。（1）固液分离技术（2）细胞破碎技术（3）初步分离纯化技术（4）高度分离纯化技术（5）其他新型分离技术主要开发了沉淀、离子交换、萃取、超滤等技术。较早出现的是酶及蛋白质的盐析法；有机溶剂沉淀法；双水相萃取技术比较适合于胞内活性物质和细胞碎片的分离，为进一步纯化精制创造了前提；超滤技术解决了生物大分子对pH、热、有机溶剂、金属离子敏感等难题，在生物大分子的分级、浓缩、脱盐等操作中得到了广泛的使用。（1）固液分离技术（2）细胞破碎技术（3）初步分离纯化技术（4）高度分离纯化技术（5）其他新型分离技术小分子物质一般可通过离子交换、脱色和结晶、重结晶等方法获得纯度很高的产品。生物大分子的纯化一直是个难题。20世纪70年代以来，逐渐开发出各种色谱（层析）技术，如亲和色谱、疏水色谱、聚焦色谱、离子交换色谱和凝胶色谱等，后两种技术已开始用于批量生产。（1）固液分离技术（2）细胞破碎技术（3）初步分离纯化技术（4）高度分离纯化技术（5）其他新型分离技术超临界CO2萃取技术在获得天然生物物质方面有着独特的优势。20世纪80年代以来，已经在许多领域中迅速实现了工业化。如啤酒花中有效成分和咖啡豆中咖啡因的萃取分离。介于反渗透和超滤之间的纳米滤（Nanofiltration）技术，由于其能使水和大部分无机盐通过而截留分子量300-1000u的小分子有机物，且操作压力低，在生物工业和水处理中具有广阔的应用前景。渗透蒸发技术、液膜技术及反胶团技术的研究和应用开发等也相继取得了很大的进展。四、下游加工过程的一般流程和单元操作1)培养液（发酵液）的预处理和固液分离；2)初步纯化（提取）；3)高度纯化（精制）；4)成品加工。1.一般下游加工过程可分为4个阶段2.下游加工过程的一般流程（沉淀、吸附、萃取、超滤、结晶）发酵液初步纯化细胞碎片分离细胞破碎细胞分离高度纯化成品加工预处理胞外产物（加热、调pH、絮凝）（过滤、离心分离、膜分离)（匀浆、研磨、酶解）（离心分离、双水相萃取、膜分离）（重结晶、离子交换、色谱分离、膜分离）（浓缩、无菌过滤、干燥、成型）胞外产物提取精制——产品的收得率和质量控制。下游工艺过程决定于产品的性质和要求达到的纯度如产品为菌体本身，则工艺比较简单，只需经过滤、得到菌体，再经干燥就可，如单细胞蛋白的生产。如可以从发酵液直接提取，则可省去固液分离步骤。如为胞外产物则可省去细胞破碎步骤。3.单元操作①过滤、离心——固液分离；②蒸发、蒸馏、结晶——进一步纯化；③萃取——浓缩或提取液相中的成分；④离子交换、层析、膜技术、超滤；⑤干燥固液分离—过滤、离心过滤时，料液经进料泵输入进料通道，分别进入滤框，液体穿过过滤介质进入滤板，从滤板上的滤液出口经滤液通道汇集后从止推板滤液口排出。板框压滤机作用原理4.部分单元操作相关设备其他形式的板框压滤机离心利用固体和液体之间的密度差将其进行分离使用的仪器是离心机离心机活塞推料离心机落地式离心机台式离心机小型离心机细胞破碎胞内产物提取前必须破坏细胞膜，使产物得以释放；常用的手段是将整个细胞破碎，因此习惯上称该操作为细胞破碎；该步骤是提取胞内产物的关键步骤，它影响产物的活性、收率和成本.细胞破碎技术其中，珠磨法、高压匀浆法、已经在工业生产上应用；酶溶法和化学渗透等方法目前实验室研究开发也相当活跃。虽然压榨法和冻融法等在实验室范围经常使用，但其工业应用受到诸多因素的限制。超滤装置膜过滤法指以压力为推动力，依靠膜的选择性，将液体中的组分进行分离的方法，包括微滤（MF）、超滤（UF）、纳滤（NF）和反渗透（RO）四种过程。各过程的适用范围不同，其中超滤的膜孔径是0.001～0.02μm。超滤的工作原理是原液通过泵，在一定的压力下通过超滤装置，溶剂和小于膜截流分子量的物质透过膜，俗称超滤液（后称过滤液），而大于膜截留分子量的物质被截留，如返回到原液中，则原液的浓度会逐渐升高，俗称浓缩液，如此反复，从而实现大小分子量的分离，浓缩和提纯的目的。市售的超滤器大致有四种型式：管式、中空纤维式、螺旋卷绕式和平板式。型式优点缺点管式易清洗，无死角，适宜于处理含固体较多的料液，单根管子可以调换保留体积大，单位体积中所含过滤面积较小，压力降大中空纤维式保留体积小，单位体积中所含过滤面积大，可以逆洗，操作压力较低，动力消耗较低料液需要预处理，单根纤维损坏时需调换整个模件螺旋卷绕式单位体积中所含过滤面积大，换新膜容易料液需要预处理，压力降大，易污染，清洗困难平板式保留体积小，能量消耗界于管式和螺旋卷绕式死体积大中空纤维超滤器萃取萃取是利用被提取物在两相中的分配不同而实现分离的单元操作。对于生物大分子，如蛋白质和酶等，加入有机相会使其失活，自20世纪80年代开始使用双水相法萃取蛋白质。其操作是向水相中加入溶于水的高分子化合物，如PEG或葡聚糖，可以形成密度不同的两相（有时甚至是多相）：轻相富含某一种高分子化合物；重相富含盐类或另一种高分子化合物。因两相均含有较多的水所以称为双水相。色谱分离法利用多组分混合物中各组分物理化学性质（如吸附力、分子极性、分子形状和大小、分子亲合力、分配系数等）的差别，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中。当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分物理化学性质的差别，而以不同的速率移动，使之分离。吸附色谱：混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，由于固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的方法。分配色谱：利用混合物中各物质在两液相中的分配系数不同而分离。离子交换色谱：基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，由于混合物中不同溶质对交换剂具有不同的亲合力而将它们分离。凝胶色谱：凝胶为固定相，是一种根据各物质分子大小不同而进行分离的色谱技术，又称为分子筛色谱、空间排阻色谱或尺寸排阻色谱。亲合色谱：生物体中许多大分子化合物具有与其结构相对应的专一分子可逆结合的特性，把与目的产物具有特异亲合力的生物分子固定化后作为固定相，当含有目的产物的混合物（流动相）流经此固定相时，即可把目的产物从混合物中分离出来。离子交换装置气相色谱仪液相色谱仪适合于大规模工业化生产的传统技术经过改造提高后，适应面更宽，效率会更高，仍然显示出强劲的生命力。各种新型高效的过滤机械和离心机械的问世，结晶理论和离子交换技术的新进展，提高了产品的收率、质量和生产效率。五、下游技术的发展动态——成本、质量、环保将是该技术发展方向和动力1.传统分离技术的提高和完善1）新型分离介质的研究开发2）子代分离技术3）其他新兴下游技术2.新技术的研究开发膜（膜材料和膜制造工艺）、树脂（离子交换树脂和大网格树脂）和凝胶（琼脂糖凝胶为基质，与各种配基结合后制成各种色谱分离介质）是目前主要的新型分离介质。各种分离纯化技术相互结合、交叉、渗透，形成子代分离技术。如膜技术和萃取、蒸馏、蒸发技术相结合形成了膜萃取技术、膜蒸馏及渗透蒸发技术；色谱技术与离子交换技术等结合形成了离子交换色谱、等电聚焦色谱等。由溶剂萃取技术衍生出一大批生物工业分离技术，如双水相萃取、超临界CO2萃取、反胶团萃取（细胞碎片去除、细胞胞内物质、酶及蛋白质、天然生物物质的提取分离）；菌体絮凝技术和菌体细胞破碎技术的进展为工业化经济地分离菌体细胞和大规模生产胞内物质创造了技术前提。本章要求熟悉下游加工过程的重要性和特点了解下游加工技术的发展过程掌握下游加工过程的主要步骤和主要单元操作了解产物提取分离所涉及的相关设备