搜索
生物化学实验生物化学实验内容1、醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质2、双缩脲测定蛋白质的含量3、血液葡萄糖的测定4、牛乳酪蛋白提取与鉴定5、维生素C的提取与含量的测定6、琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制7、酶的基本性质要求：课前预习，试验中做记录，课后写实验报告。两人一组，离开实验室时签字。实验一血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳一、目的：了解电泳技术基本原理，掌握醋酸纤维薄膜电泳操作技术。二、原理：蛋白质是两性电解质，在非等电点状态下在电场中会向一定电极移动。在碱性条件下多数蛋白质带负电荷，在电场中向正极移动，不同蛋白质由于大小、所带电荷及形状不同，在电场中的迁移率不同，经过电泳可将其分开，结果经染色、漂洗，得电泳图谱。材料：血清pH8.6巴比妥缓冲液滤纸吸去膜上液体醋酸——————————→浸泡——————————→点样纤维薄膜10min沾血清点在无光泽面上2mA/条膜染色液漂洗液—————→电泳—————→染色———————→漂洗40min5min浸泡漂洗数次——→观察电泳谱带电泳槽示意图滤纸桥+——点样处——+醋酸纤维薄膜电泳图谱薄膜点样端三、步骤：电泳装置点样实验二双缩脲测定蛋白质含量一、实验目的掌握双缩脲测定蛋白质的方法和原理二、实验原理双缩脲在碱性溶液中与Cu2+产生紫色的络合物,这一反应称“双缩脲反应”。蛋白质分子中肽键，也能与Cu2+发生双缩脲反应，溶液紫色的深浅与蛋白质含量在一定范围内成正比，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关。该紫色的络合物在580nm处有最大吸收值。三、实验步骤1、标准曲线制作（已制好）2、样品测定编号123豆粉（g）00.10000.1000碳酸铜（g）1.001.001.00无水乙醇（ml）2020.0020.0010%KOH（ml）2020.0020.00振荡10min，静置片刻，将上清过滤后580nm测定吸光值OD540标线上查出的Pr的量3、结果计算×100=豆粉（g）样品蛋白质含量（%）y=0.163xR2=0.99400.020.040.060.080.10.120.140.1600.20.40.60.81OD580酪蛋白克数标准曲线上查得蛋白质含量（g）实验三血液葡萄糖的测定一、实验目的学习和掌握Folin-吴宪法测定血糖的方法二、实验原理G＋Cu2+碱性氧化亚铜磷钼酸＋钼蓝420nm处有大吸收峰三、实验步骤血糖试剂（ml）空白管低浓度标准管高浓度标准管测定管无蛋白血滤液蒸馏水标准葡萄糖应用液碱性铜试剂—2.0—2.0—1.01.02.0——2.02.01.01.0—2.0混匀，置沸水浴中煮8分钟，取出，用流动的自来水冷却3分钟（切勿摇动血糖管）磷钼酸试剂2.02.02.02.01：4磷钼酸溶液加至25252525OD420测定管光密度100×0.2×=葡萄糖mg/100ml标准管光密度0.1高标准管：低标准管：×0.1×=葡萄糖mg/100ml标准管光密度0.1测定管光密度100四、计算实验四牛奶中蛋白质的提取与鉴定一、实验目的学习从牛奶中制备酪蛋白的方法并进行鉴定试验二、实验原理蛋白质等电点沉淀三、实验步骤1、酪蛋白的制备鲜牛乳3Oml（40℃）+3Om醋酸缓冲液（40℃）边加边摇动离心3000r/5min冷却至室温，继续放置5分钟清液（乳清）沉淀加热观察现象醇醚混合物洗2次沉淀清液晾干，鉴定弃掉2、酪蛋白的性质鉴定（1）溶解度观察溶液H2O10%NaCl0.5%Na2CO30.1MNaOH0.2%HCl饱和Ca(OH)2试剂量2ml2ml2ml2ml2ml2ml酪蛋白少许少许少许少许少许少许溶解情况2.米伦反应：少许酪蛋白+lmlH2O+米伦试剂10滴，振摇，加热观察其颜色变化3.含硫(胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸)测定:少量酪蛋白+lmlO.1MNaOH+5%醋酸铅1-3滴观察现象煮沸实验五维生素C的定量测定（2，6-二氯酚靛酚滴定法）一、实验目的掌握滴定法测定Vc含量的原理和操作。二、实验原理三、实验步骤1.提取:2.0克松针（2份）+少量2%草酸匀浆过滤后用2%草酸定容到50毫升（也可先定容后过滤或离心）2、滴定（1）标定染料（标准维生素C液滴定）：准确吸取标准维生素C溶液10毫升（含1.0毫克维生素C）置100毫升锥形瓶中，用微量滴定管以0.1%2，6一二氯酚靛酚滴至淡红色出现，15秒钟不退色即为滴定终点。记录所用染料体积计算出1毫升染料相当于多少毫克维生素C（K值），即1/染料ml。(2)样液滴定:准确吸取滤液10毫升放人100毫升锥形瓶内，滴定方法同前(做两次平行试验)，记录染料体积。(3)空白液滴定：准确吸取10毫升2%草酸溶液，放入100毫升锥形瓶中，用上述方法滴定至终点，记录所用染料体积。（滴定过程宜迅速，一般不超过2分钟）X=（V1－V2）×K×VW×V3×100X：100克样品所含维生素C毫克数W：称取样品毫克数V1：滴定样品所用染料毫升数V2：滴定空白所用染料毫升数V3：样品测定时所用滤液毫升数（即10毫升）V：样品提取液稀释至总体积（即50毫升）K：1毫升染料所能氧化维生素C之毫克数，可由标定算出3、计算实验六琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察一、实验目的了解琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制剂对其活性的抑制。二、实验原理甲烯白琥珀酸脱氢酶延胡索酸琥珀酸甲烯蓝NAD+NADH无氧丙二酸－三、实验步骤1、酶的制备猪心1.5～2g+1/15M磷酸氢二钠溶液3～4ml匀浆1/15M磷酸氢二钠溶液6～7ml，放置30min2000r/min离心10min，取上清备用。试管号心脏提取液（滴）1.5%琥珀酸钠（滴）1%丙二酸钠（滴）蒸馏水（滴）0.02%甲烯蓝（滴）现象155——25225（煮沸）5——252355520245255——2加好混匀，立即在各管中加入一层（约8滴）液体石蜡油，置37度恒温水浴保温30分，观察各管颜色变化，分析原因。然后用力振摇1号管，观察变化记录并解释。2、酶促反应实验一、温度、pH及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响一、目的：了解酶催化的特异性以及pH、温度、抑制剂和激活剂对酶活力的影响二、实验原理以唾液淀粉酶为例，观察温度、pH、激活剂和抑制剂对其活性的影响。唾液淀粉酶可水解淀粉生成糊精、麦芽糖、葡萄糖等物质。淀粉遇碘呈呈蓝色。糊精按分子从大到小的顺序，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色;最小的糊精和麦芽糖遇碘不呈现颜色反应。酶具有极高的催化效率，过氧化氢酶比铁粉的催化效率高出许多倍。三、操作步骤（一）温度对酶活性的影响（唾液淀粉酶的制备：取漱口水0.5Ml，稀释至50ml，以下简称酶液）1、取3支试管，编号后按下表操作2、在比色板上，置碘液2滴于各孔中，每隔1分钟，从第二管中取出反应液1滴与碘混合，观察颜色变化。3、待第二管中反应液遇碘不发生颜色变化时，向各管中加入碘液1滴，摇匀，观察并记录各管颜色，做出解释。试管号0.5%淀粉溶液稀释酶液温度（10min)现象1235ml5ml5ml1ml1ml1ml0℃水浴37℃水浴沸水浴管号1230.5%淀粉222pHpH5.02pH6.82pH8.22稀释唾液（滴）101010现象二、pH对酶活性的影响取试管5支，编号，按下表操作。摇匀，37℃水浴中保温。每隔l分钟从pH6.8的管中（2号）取出1滴于白瓷板上，加碘液1滴，观察淀粉水解的程度。待颜色不变时，向各管中加碘液1-3滴。观察颜色，比较水解程度，做出解释。三、酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响（氯离子是唾液淀粉酶的激活剂，铜离子是抑制剂）：取小试管3支，按表操作试管号0.5%淀粉1%CuSO40.5%NaCl蒸馏水稀释唾液结果1232ml2ml2ml1ml0001ml0001ml1ml1ml1ml将3支试管放入37℃水浴中，在比色板上用碘液检查第2管，待不变色时向各管中加碘液1滴，记录颜色并解释。四、酶的高效性酶具有极高的催化效率，比普通催化剂活性高出很多倍。过氧化氢酶能催化过氧化氢分解为二氧化碳和水，铁粉也能催化此反应，但二者的催化效率有很大差距。取小试管4支，编号，按下表操作。试管号12342%H2O2（ml）3333生马铃薯少许熟马铃薯少许铁粉少许现象解释恒温水浴锅电磁炉水浴锅电子天平需冷藏、冷冻试剂和材料放在冰柜和冰箱注意生物材料及试剂在冰箱中，取完放回原处。请勿将固体物质扔进水槽，台面上有垃圾盆。水槽上有蒸馏水管，节约使用。用过器皿立即用水洗净。做完实验清理台面，将实验用具清洗后放入洗涤柜。实验报告一、目的二、原理（必须写清楚！）三、实验材料四、实验步骤五、结果与分析标出正负极，说明从正极到负极的条带依次是…..。-+