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1生物技术概论细胞工程生物工程专业课程吉林工程技术师范学院2第一节细胞培养的设施、条件及方法3•研究基础：细胞学•操作对象：细胞或组织•基本技术：细胞与组织培养4一、细胞工程的基本原理1.1细胞工程的概念及研究范畴1.2细胞工程的基础知识1.3细胞工程的理论核心51.1细胞工程的概念及研究范畴•概念：应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的试验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科。•研究范畴：广义的细胞工程包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术，狭义的细胞工程则是指细胞融合和细胞培养技术。根据研究对象不同，细胞工程可分为动物细胞工程、植物细胞工程和微生物细胞工程。61.2细胞工程的基础知识生物界有两大类细胞：原核细胞与真核细胞。原核细胞：DNA裸露于细胞质中，不与蛋白质结合，易于人们的遗传操作；生长迅速；胞内无膜系构造细胞器；是细胞改造的良好材料。真核细胞：胞内有细胞核和众多膜系构造细胞器；一般都有明显的细胞周期，处于有丝分裂时期的染色体呈现高度螺旋紧缩状态，既不利于基因外钓，也不利于外源基因的插入。可采取一定的措施诱导真核细胞同步化生长。植物细胞外还有数层以纤维素为主要成分的细胞壁。7动物细胞结构图细菌细胞模式图81.3细胞工程的理论核心1.3.1细胞全能性概念1902年，德国植物学家Haberlandt提出了细胞全能性的假想。1934年，White首次定义为:每个植物活细胞在合适的条件下，都有发育为胚的能力。70年代，扩大了以上定义范围，认为：植物活细胞不但能形成胚状体，而且能发育为完整植株。80年代初，认为：任何植物的离体细胞在人工培养下都具有它们母体植株的那种合成药用成分的能力，即培养细胞的药物生物合成的能力。9目前细胞全能性定义：每个植物活细胞都具有该物种的新陈代谢、应激性和自体复制等生命基本属性，在合适的离体培养条件下，可以展现这些特征属性。101.3.2植物活细胞具有生命特征属性•生命特征属性•细胞具有生命特征属性•离体培养细胞展现该物种的生命特性11•生命特征属性：新陈代谢、应激性、自我复制121.新陈代谢：是指维持生命各种活动过程中的化学变化的总称。生物体总是不断地从环境中摄取物质和能量，来维持自身。又有同等量的能量，以热或者其他形式排出体外。一旦新陈代谢停止，生命活动也就停止，生物体就会瓦解。即，生物体要维持生命，必须吐故纳新。132.应激性：是指生物体随环境变化的刺激而发生相应反应的特征。生物体的生存离不开环境条件，而环境又是不断变化的。除四季有规律的变化外，还有些急剧变化，如干旱、涝灾、高温、低温、昆虫侵害等等。生物体具有“某种机制”来感知和正确估计环境的变化，以便在体内加以校正，保证体内平衡，来应付突变的环境。143.自我复制：是指生物体利用自身作模板，通过代谢作用，复制出完全相同的结构，或产生也具有相同的自体繁殖能力的突变结构。前者为“遗传”，后者为“变异”。“遗传”保证了物种的纯化，“变异”为物种的进化提供依据。自我复制实现了遗传与变异的矛盾统一。15细胞具有生命特征属性生物体由细胞组成，所以细胞也具有生命特征属性。细胞是生物体结构和功能的基本单位。核酸是构成细胞的重要物质，携带着遗传信息，并具有自我复制的能力，但当单独存在时，不能表现出生命特征属性。只有组成细胞时，才能表现完整的生命活动。16同一个体每一个体细胞所含的基因是相同的，但细胞结构和功能往往不同（如根细胞具有吸收水分和养分的作用；叶片具有光和、蒸腾作用等）。所以说，并非每个细胞能把全部遗传信息都表达出来。有的基因在这些细胞中表达，另一些基因在另一些细胞中表达。即，生命的全部属性在不同的细胞中分别表达。17离体培养细胞展现该物种的生命特性1.培养细胞的新陈代谢在适宜条件下，离体细胞能够存活，则具有新陈代谢特性。如：绿色细胞具有光自养能力；培养细胞具有该物种的“药物生物合成的能力”。182.培养细胞的应激性在适宜培养条件下，离体细胞具有应激性：植物组织切割损伤后，应激于培养条件而出现脱分化，并在适宜的条件下再分化（芽和根）。193.培养细胞展现自体复制特性再分化植株植物组织脱分化愈伤组织（脱分化细胞）2021•细胞工程是生命科学领域的一个组成部分。就学科而言，它是涉及细胞生物学、发育生物学和遗传学等多门学科的综合科学。•细胞工程以细胞培养技术、细胞融合技术为基础，现已被广泛应用于多个学科的基础研究工作以及农业、医药与食品等生产中。•近年来细胞工程的开发和应用主要集中在细胞杂交，快速无性繁殖和细胞育种等方面。细胞工程在新技术革命的浪潮中对农业、食品等传统工艺革新有着重大的影响。22细胞工程所涉及的主要技术有：细胞培养技术、细胞融合技术、细胞器移植和细胞重建技术、染色体工程技术、体外授精、胚胎移植技术和生物反应器技术等;在食品工业中应用较广泛的细胞工程技术主要是细胞培养技术、细胞融合技术、细胞重建技术及细胞代谢物的生产技术等。细胞工程的基本技术231．细胞培养技术细胞培养技术是指动物和植物细胞在体外无菌条件下的保存和生长。即将机体内某一组织取出，使其分散成单个细胞，在体外人工的生长条件下培养，使细胞生长和不断增殖。24细胞培养25植物组织培养262．细胞融合技术指两种不同亲株经酶法去除细胞壁得到两个原生质体，并在助融剂作用下互相凝集并发生细胞间的融合，进而导致基因重组，获得新菌株。其融合频率明显高于常规杂交数倍至几十倍。对促进基因重组、遗传育种、选育优良品系，以达到高产优质具有重要实践意义。273．细胞器移植和细胞重建技术所谓核移植技术就是利用显微操作技术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中，或者将两个细胞的细胞核（或细胞质）进行交换，从而可能创造无性杂交生物新品种的一项技术。克隆羊282930动物细胞工程主要应用于培养有生理活性的物质，如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。由于动物细胞工程的复杂性及精密性，促进动物细胞大量培养的新工艺、新技术不断涌现;其中关键技术包括：无血清细胞培养基的开发，灌注悬浮培养、贴壁细胞培养、固定化细胞培养等培养技术的应用等。31动物细胞结构32植物细胞工程主要指植物细胞培养技术，以前称之为植物组织培养，是一种将植物的组织、器官或细胞在适当的培养基上进行无菌培养技术。最常见的植物细胞培养技术有愈伤组织培养、悬浮细胞培养、器官培养、基尖分生组织培养、原生质体培养和固体化细胞培养几大类型。33植物细胞结构344、染色体工程将单个染色体或染色体组转入或移出受体细胞，从而形成新的染色体组合和遗传构成。广泛用于优良品种的培育，如多倍体的育种。355、胚胎工程•胚胎工程是以生殖细胞和胚胎细胞为对象进行的细胞工程操作，主要技术包括体外受精、胚胎移植、胚胎切割等。366、干细胞与组织工程•干细胞是动物体内具有分化潜能、并能自我更新的细胞，分为胚胎干细胞和组织干细胞。377、转基因与生物反应器（1）转基因动物（2）转基因植物38二细胞培养的设施、条件及方法•主要介绍细胞工程实验室的设置及其所需要的基本条件。•细胞工程实验室与其他一般实验室的主要区别在于，要求保持严格无菌环境，避免微生物及其他有害因素的影响。一般来讲，它应能进行六方面的工作：无菌操作、培养、制备、清洗、消毒灭菌处理和贮藏。392.1细胞工程实验室的设置1.无菌操作室无菌操作室是相对密封、防尘、防菌的工作空间，在结构和消毒方面都有基本的要求。2.1.1动物细胞工程实验室的设备40超净工作台412.培养和观察室需要清洁无灰尘。孵育可在培养箱或可控制温度的温室中进行，一般实验室多采用培养箱进行。423.制备室该区主要进行培养液及有关液体的制备，在用天平、PH计、磁力搅拌器等设备下完成制备以后，应在无菌操作台进行过滤除菌。434.储藏室储藏室的主要设备有冰箱、液氮罐、储物柜等，还有一些器皿等，对储藏室的要求是取放方便。445.清洗和灭菌室应与其它区分开，主要有消毒柜、干燥箱和纯水制备等设备，进行所有细胞培养器皿的清洗、准备、消毒及纯水制备等工作。452.1.2植物细胞工程实验室的设置植物细胞工程实验室除具有与动物细胞工程实验室相似的无菌操作室、制备室、清洗和灭菌室外，还有其特殊的设置，如具有光照条件的培养室、温室和驯化室等。461、无菌操作室2、培养室培养室的温度应当是可控的，一般保持在25℃左右。3、鉴定室4、清洗室5、灭菌室6、制备室7、驯化移植室472.2常用仪器与设备1、超净工作台482、倒置显微镜使用倒置显微镜定期检查培养细胞器皿中的细胞生长情况，可及时调整培养条件。若发现污染，可根据污染类型决定补救措施和处理方案。若能配置带有相机系统的高质量相关显微镜，效果更佳。493、电热干燥箱用于细胞培养中的有些器械、器皿需要烘干时使用，玻璃器皿也需要干燥消毒。实验室常用的是鼓风式电热干燥箱，其优点是温度均匀、效果良好，缺点是升温过程较慢。504、水纯化装置细胞培养对水的质量要求很高，所有与培养细胞接触的液体均需要纯水配成。水可采用离子交换纯水装置或蒸馏器纯化。515、冰箱细胞培养室必须配备普通冰箱或冷藏柜，最好还有一台低温冰箱（-20℃）。前者用于贮存各种溶液和短期保存组织标本等，-20℃低温冰箱则用于储存需要冷冻保持生物活性及较长时期存放的制剂，如酶、血清、配置的抗生素等。526、压力蒸汽消毒器7、细胞计数板和电子细胞计数仪8、过滤除菌装置9、离心机10、移液管和吸管11、离心管12、移液器13、天平532.2.2动物细胞工程实验室的常用仪器设备1、培养箱2、显微操作仪3、细胞融合仪4、细胞冷冻储存器5、培养用器皿6、手术器械542.2.3植物细胞工程实验室的常用仪器设备1、光照培养箱2、人工气候箱3、摇床4、培养瓶552.3实验室的生物安全在进行细胞与组织培养时，尤其是含有病原的生物材料的培养，不仅要保证培养物不受污染，也要保证培养物不会对实验人员和环境造成污染。56清洗的主要目的是清除培养器皿中的杂质和微生物等影响细胞生长的成分。清洗后的玻璃器皿要干净、透明、无油质，且无任何残留物质。清洗完毕后的器皿在消毒前必须进行严密包装，以便消毒及储存，防止落入灰尘及消毒后再次被污染。3清洗与消毒57严格的消毒灭菌对保证细胞培养的成功是极为重要的。细胞培养过程中主要使用两类消毒方法，即物理灭菌法和化学灭菌法。不同的灭菌方式适用于不同的物品，如紫外线法适用于无菌室或超净工作台的台面等大面积消毒，高压蒸汽消毒适用于玻璃器皿，过滤除菌适于含有不耐热成分的培养基和试剂的消毒，化学消毒适用于实验室、无菌室的桌面、物体表面的消毒。58过滤除菌器593.1清洗3.1.1玻璃器皿的清洗3.1.2胶塞的清洗3.1.3塑料制品的清洗3.1.4G6除菌滤器的清洗3.1.5不锈钢除菌滤器的清洗3.1.6包装603.1.1玻璃器皿的清洗组织细胞培养中使用量最大的是玻璃器皿。一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤。清洗后的玻璃器皿要求干净、透明、无油迹，且无任何残留物质。611、浸泡新瓶使用前都需要先用清水浸泡，以软化和溶解附着物。新的玻璃器皿在生产过程中常使玻璃表面呈碱性，并带有一些对细胞有毒的物质（如铅和砷等），同时常有许多灰尘。可先用自来水简单刷洗，后用稀盐酸浸泡过夜。培养后的器皿立即浸入水中以便刷洗。622、刷洗将浸泡后的玻璃器皿放到清洗剂溶液中，用软毛刷沾洗涤剂反复刷洗以去除器皿内外表面的杂质。需注意两点：一是防止损伤器皿表面光洁度以免影响细胞生长；二是不能有死角。633、浸酸清洗液由浓硫酸、重铬酸钾及蒸馏水配制而成，具有很强的氧化作用，去污能力很强，对玻璃器皿无腐蚀作用。这是关键的一个环节。在配制清洗液的时候要小心，注意安全，防止烧伤皮肤及烧坏衣服。644、冲洗玻璃器皿在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗，使之尽量不留污染或清洁液的残迹。冲洗最好用洗涤装置，既省力，效果又好。如用手工操作，则需流水冲洗10次以上。653.1.2胶塞的清洗–胶