第7章干细胞与组织工程上

上回说到:第6章胚胎工程Q1：简要介绍人类的辅助生殖技术。Q2：简要介绍哺乳动物性别控制的主要方法及意义。第7章干细胞与组织工程什么是干细胞(stemcells)干细胞是具有自我复制和多项分化潜能的原始细胞，是机体的起源细胞，是形成人体各种组织、器官的祖先细胞。干细胞的分类按来源分类胚胎干细胞成体干细胞按分化潜能分类多能干细胞全能干细胞专能干细胞胚胎干细胞和成体干细胞的比较定义:当受精卵分裂发育成囊胚时，内细胞团的细胞就是胚胎干细胞。特点：具有很强的分化能力，可以无限增加，并且可以分化成全身２００多种细胞类型。总结：它能长成动物的任何组织和器官成体干细胞位于成体的组织和器官特点：在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序进行分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。Whatisastemcell?•A:AcellthatcanmakecopiesofitselfANDmakemorespecializedtypesofcell•B:Acellthathelpstofightagainstinfections•C:Acellthatisspecialized•D:Acellthatcanproduceallthecelltypesofthebody√Wherecanscientistsobtainstemcells?•A:Onlyfromanembryo•B:Onlyfromadulttissues•C:Onlyfromthebrain•D:Fromanembryooradulttissues√干细胞是研究的热点2006年2月9日，国务院发布的《国家中长期科学和技术发展规划纲要(2006-2020年)》部署了四项重大科学研究规划，发育与生殖研究位列其中。2007年欧盟经过长时间的辩论后决定拨款资助人类干细胞研究。而此前，美国总统布什首次动用否决权，驳回胚胎干细胞研究的法案，引起轩然大波。这个事件在科学、伦理和政治的揪扯下，愈演愈烈，最后终于引发了一场激烈的“文化战争”。（视频1）中国人对胚胎干细胞研究的看法比较一致•大多数中国人能够接受此项研究,主要是受儒家思想的影响。儒家很早以前就已经指出，人生出来的时候，人才开始。按照大多数中国人的看法，胚胎还不是人，不涉及人权问题。7.1胚胎干细胞（embryonicstemcells,ES细胞）四个基本问题:什么是ES细胞？（定义）如何分离培养ES细胞（建系）如何鉴定ES细胞？ES细胞有何应用价值？受精卵裂受精后72h受精后5-7天精子+卵子合子卵裂球桑椹胚囊胚blastocyst滋养层胎盘及胎儿附属结构囊胚内胚层消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰。内细胞团中胚层结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统外胚层体表结构；神经系统人早期胚胎发育Ablastocystis…•A:Averyearlystageembryo•B:Atypeofstemcell•C:Partofthebloodsystem•D:Atypeofbraincell√定义胚胎干细胞?????是从早期胚胎内细胞团(或生殖脊)分离，并经体外抑制分化培养所获得的干细胞。这些细胞能在体外进行长期培养增殖，且保持高度未分化状态和正常二倍体核型，具有发育的全能性，能分化出成体的所有种类的细胞（组织和器官），包括生殖细胞。胚胎干细胞（embryonicstemcells,ES细胞）胚胎生殖细胞（embryonicgermcells,EG细胞）7.1.1胚胎干细胞的研究历程1981年，MartinEvans鼠1995年，Thomson猴1998年，Thomson&Gearhart人1981年，英国剑桥大学的MartinEvans等首次于用延迟着床的小鼠囊胚建立起未分化的ES细胞系•JamesA.Thomson在Wisconsin大学领导一个研究小组从人胚胎组织中培养出了干细胞株。他们使用的方法是：人卵体外受精后，将胚胎培育到囊胚阶段，提取内细胞团，建立细胞株。经测试这些细胞株的细胞表面标志和酶活性，证实它们就是胚胎干细胞。(Science,1998(l282):1145-1147)•JohnD.Gearhart在JohnsHopkins大学领导另一个研究小组也从人胚胎组织中建立了干细胞株。他们的方法是：从受精后5－9周人工流产的胚胎中提取原始生殖细胞(primordialgermcell)。由此培养的细胞株，证实具有多能干细胞的特征。(PNAS,1998(l95):13726-13731)•ScientistsJamesThomsonandJohnGearhartjoinedpatientadvocateChristopherReevetodiscussstemcellresearch霍金批评欧美人士试图禁止人类胚胎干细胞研究※1999年12月，美国《科学》杂志公布了当年世界科学进展的评定结果，干细胞的研究成果列在举世瞩目耗资巨大的人类基因组工程之前，名列十大科学进展首位。※2002年3月，美国麻省理工学院的科学家宣布，他们首次利用人体胚胎干细胞培育出毛细血管，证明了胚胎干细胞技术在治疗心血管疾病等领域的应用潜力。※目前已有报导ES细胞能在适当条件下分化为心肌细胞，胰岛细胞，血管内皮细胞，肝细胞等。新进展7.1.2胚胎干细胞的生物学特性•参见7.1.4ES细胞的鉴定7.1.3胚胎干细胞的建系•分离＋培养１分离方法：(1)利用干细胞特征分离(2)免疫外科学方法(3)酶解法(4)显微外科学方法(1)利用干细胞特征分离流式细胞仪分离法被Hoechst33342和Rhodamine123低染细胞膜表面特殊标志：SSEA-3SSEA-4TRA-1-60TRA-1-81(2)免疫外科学方法去除滋养层细胞分离方法(3)酶解法：酶消化去除滋养层细胞后培养(4)显微外科学方法：去除滋养层细胞后培养２ES细胞的分化抑制培养在ES细胞的培养过程中，一方面要给以足够的营养物质以满足其增殖的需要，另一方面要抑制其分化，其中前者由基础培养基来解决，后者则由分化抑制物来完成。分化抑制物的选择目前有三种分化抑制物比较常用：饲养层（feederlayer）条件培养基（conditionedmedium，CM）白血病抑制因子（leukemiainhibitoryfactor,LIF）饲养层细胞feeders是将选用的细胞经γ射线照射或经丝裂霉素C（mitomycinC）处理而阻断其有丝分裂所得到的细胞层。常用的有STO（一种已成系的小鼠成纤维细胞）、原代小鼠胎儿成纤维细胞、同源胎儿成纤维细胞和子宫上皮细胞，其中前两种比较常用。饲养层细胞要铺满抑制分化的因子——白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor,LIF)ES细胞培养常用含有LIF的培养基（高糖）和饲养层细胞来阻止细胞的分化•条件培养基：是将大鼠肝细胞等细胞培养一定时间后，回收细胞培养液，经一系列处理后制为贮存液，使用时以一定比例加到ES细胞培养基中。许多实验室经常用条件培养基取代饲养层来维持ES细胞。其优点是使ES细胞直接利用培养细胞分泌到培养液中的生长因子，可消除饲养层细胞的干扰，免受丝裂霉素C致癌剂的影响，而且操作比较简单。建系胚胎干细胞建系(flash2)胚胎干细胞集落分离囊胚的内细胞群与饲养层细胞共培养，ES细胞非分化增殖分离胚胎生殖脊细胞------胚胎干细胞的鉴定------定向诱导分化-------前体细胞-----功能细胞小结:胚胎干细胞的建系过程（1）细胞形态特征、取材部位（2）细胞表面的特殊标志（3）细胞内干细胞标志基因的表达（4）端粒酶（5）核型分析体内分化（6）分化潜能体外分化嵌合体:小鼠胚胎干细胞已经制备嵌合体7.1.4胚胎干细胞的鉴定•形态学鉴定：典型的ES细胞体积较小，有一个大核，核内有一个或多个明显的核仁，胞质较少。细胞之间界限不清晰，紧密聚集呈鸟巢状克隆。胚胎干细胞克隆胚胎干细胞的特性胚胎干细胞生殖干细胞SSEA-1－＋SSEA-3＋＋SEA-4＋＋TRA-1-60＋＋TRA-1-81＋＋AKP＋＋Oct-4＋未知端粒酶活性＋＋饲养层细胞＋＋培养条件分化抑制培养LIF＋bFGF＋Forskolin细胞内干细胞标志基因的表达碱性磷酸酶染色，呈阳性免疫组织化学染色RT－PCR分析核型保持正常分化能力检测•ES细胞具有发育全能性，这是其区别于其它细胞的显著特点。ES细胞一旦脱离饲养层或除去分化抑制物后进行培养，会自发分化为多种细胞。在某些物质的诱导下，一些特定基因的表达会受到调节，从而使ES细胞发生定向分化。分化能力分化能力检测①体外分化试验：将所培养的细胞制成悬液在铺有明胶的培养皿中培养，则贴壁生长的ES细胞会自发地分化为各种细胞，而悬浮生长的ES细胞会形成简单类胚体，然后进一步形成囊状胚体。②体内分化试验：将一定量培养的ES细胞注入同源动物的皮下，过一段时间后会形成组织瘤，且组织瘤内有三个胚层的细胞存在。③核移植检测：将培养的细胞作为核供体注入去核卵母细胞中，观察重构胚是否正常发育。④嵌合体形成检测：将培养的细胞与受体胚胎结合并移植入同期假孕受体，ES细胞可参与受体胚胎的发育从而得到嵌合体动物，然后通过毛色判断，或同工酶检测。胚胎干细胞神经细胞脂肪细胞心肌细胞上皮细胞适当条件体外定向分化改变生长环境处理塑料平皿、加入特定生长因子等（1）加入诱导细胞分化的因子或化学物质，如VGEF、bFGF、DMSO和RA等（2）将ES细胞与特定的细胞共培养（3）将某种分化诱导因子的基因转入ES细胞内干细胞诱导分化的常用方法胚胎干细胞的体外定向诱导分化：胎牛血清，骨髓基质细胞共培养胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－造血细胞RA胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－神经细胞DMSO胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－肌肉细胞TGF-B1,VEGF,bFGF胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－血管和内皮细胞RA+胰岛素+T3胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－脂肪细胞BMP-2,BMP-4胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－软骨细胞地塞米松，磷酸甘油胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－骨细胞基因转染胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－胰岛素分泌细胞胚胎干细胞诱导分化的途径•①拟胚体的形成•②非拟胚体形成途径拟胚体Embryoidbody•在无饲养层系统中培养的ES细胞在体外可以形成拟胚体，拟胚体包含三个胚层来源的细胞，并能分化出三个胚层的细胞。目标：定向分化定向分化进展:胚胎干细胞育出心脏组织1）以色列工学院科学家首次从胚胎干细胞中培养出人类心脏组织。他们培育出的心脏组织，可以自然跳动，并且有新生心脏组织的电特性和机械性。这项实验证明：以细胞移植治疗心脏病的可能性是巨大的。此项发现，对治疗世界上最主要的一种致命疾病可能具有重大意义。2）法国科学家16日用老鼠胚胎干细胞成功治疗羊心脏病，这是第一次用老鼠干细胞来修复大型动物的心脏损伤2005年英科学家利用胚胎干细胞成功制造软骨Embryonicstemcellscandifferentiateintowhichtypesofcell?•A:Onlybrainstemcellsandspecializedbraincells•B:Alltypesofspecializedcellsinthebody•C:Onlycellsthatcanproduceinsulin•D:Onlycellsthatcanproduceartificialskin√骗局:胚胎干细胞美容•商品名称：爱丽玺尔胚胎干细胞因子商品编号：1696•香草山美容护肤中心•视频3制备嵌合体获得功能基因构建基因打靶载体转染胚胎干细胞获得基因剔除细胞系制备嵌合体筛选进入生殖系小鼠转基因小鼠（F1）表型分析选择单系同胞交配产生（F2）代