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中国农业大学现代远程教育毕业论文（设计）福建省散户断奶仔猪流行性腹泻免疫血清学监测学生xxx指导教师专业动物医学层次091批次学号学习中心工作单位2011年09月中国农业大学网络教育学院制独创性声明本人声明所呈交的毕业论文（设计）是我个人进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文（设计）中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在毕业论文（设计）中作了明确的说明并表示了谢意。学生签名：时间：年月日关于论文（设计）使用授权的说明本人完全了解《中国农业大学网络教育学院本、专科毕业论文（设计）工作条例（暂行规定）》对：“成绩为优秀毕业论文（设计），网络教育学院将有权选取部分论文（设计）全文汇编成集或者在网上公开发布。如因著作权发生纠纷，由学生本人负责”完全认可，并同意中国农业大学网络教育学院可以以不同方式在不同媒体上发表、传播毕业论文（设计）的全部或部分内容。中国农业大学网络教育学院有权保留送交论文（设计）的复印件和磁盘，允许论文（设计）被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编论文（设计）。[保密的毕业论文（设计）在解密后应遵守此协议]学生签名：时间：年月日摘要为了解福建省散养户非免疫猪猪流行性腹泻的感染情况，从福建省各地断奶仔猪抽取血清样品共264份，采用酶联免疫吸附法进行猪流行性腹泻检测，结果表明，264份血清样品中，有125份PED呈阳性，阳性率为47.35%。有118份PED呈阴性，阴性率为44.70%。有21份PED可疑，可疑率为7.95%。可见，猪流行性腹泻在福建省散养户的感染情况还是相当严重。因此我们必须提高对该病的认识及重视程度，采取综合有效措施,降低该病的发病率。关键词：猪流行性腹泻断奶仔猪抗体监测目录摘要……………………………………………………………………………………......Ⅱ1前言………………………………………………………………………………………12材料与方法………………………………………………………………………………22.1材料………………………………………………………………………………22.1.1仪器…………………………………………………………………………22.1.2试剂…………………………………………………………………………22.1.3被检血清……………………………………………………………………22.2方法………………………………………………………………………………22.2.1待检血清配置……………………………………………………………....22.2.2溶剂配置……………………………………………………………………22.2.3操作步骤……………………………………………………………………22.2.4结果判定……………………………………………………………………33结果…………………………………………………………………………………......33.1PED检测结果……………………………………………………………………33.2PED阳性率………………………………………………………………………64讨论……………………………………………………………………………………..6后记…………………………………………………………………………………………7参考文献……………………………………………………………………………………811前言猪流行性腹泻（porcineepidemicdiarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV）引起的猪的一种高度接触性肠道传染病[1]，以呕吐、腹泻和食欲下降为基本特征，各种年龄猪均易感。本病的流行特点、临阵症状和病理症状都和猪传染性胃肠炎十分相似，但哺乳仔猪死亡率较低，在猪群中的传播速度相对缓慢。猪流行性腹泻病毒为冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒属（Coronavirus）的成员。病毒形态略呈球形，在粪便中的病毒粒子呈现多形态，有囊膜，囊膜上有花瓣状纤突[2]，由核心向四周放射，其间距较大且排列规则，呈皇冠状。病毒核酸为线性单股正链RNA[3]，具有侵染性。该病毒只有一个血清型，不能凝集人、兔、猪、鼠、犬、马、羊、牛的红细胞。对外界抵抗力弱，对乙醚、氯仿敏感，一般消毒药可将其杀灭。病毒在60℃30min可失去感染力，但在4℃，pH5.0-9.0或37℃，pH6.5-7.5或50℃[4]条件下相对稳定。流行性腹泻病毒可在猪群中持续存在，各种年龄的猪都易感。但对哺乳仔猪、架子猪或育肥猪的危害更大，尤其是哺乳仔猪受害最为严重[5]。本病主要在冬季多发，夏季也可发生。病猪和带毒猪是主要传染源，病毒多经猪的粪便排出，运输车、饲养员的鞋或其他带病毒的动物都可作为传播媒介，传播途径是消化道。自然感染潜伏期5～8d，人工感染的新生仔猪18～24h，育肥猪约2d[6]，主要的临诊症状为水样腹泻，或伴随呕吐。病猪表现出呕吐、腹泻和脱水。与TGE相似，但程度轻、传播稍慢。粪便稀如水，呈灰黄色或灰色。多在吮乳或吃食后发生呕吐,此时,病猪精神极度沉郁,眼窝下陷,脱水,拒食,消瘦。日龄越小发病越重。1周内新生仔猪腹泻2-4d内因脱水死亡，死亡率达50%[7]。断乳仔猪、育肥猪、母猪症状较轻,4～7d恢复正常,成年猪仅发生厌食和呕吐。主要病理变化为小肠膨胀，充满黄色液体，肠壁变薄，个别小肠粘膜有出血点，肠系膜淋巴结水肿，小肠绒毛变短，重症者绒毛萎缩甚至消失。胃常是空的或充满胆汁样的黄色液体。其他实质性器官无明显变化。电镜观察可见肠绒毛萎缩，绒毛与肠腺的比率从正常的7∶1降至3∶1[8]。猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎的临床症状、流行病学、病理变化等无明显差异,要确诊需结合实验室诊断方法。检测方法有免疫电镜法、免疫荧光法、ELISA法、RT-PCR等[9]。比较常用的是免疫荧光法和ELISA。猪流行性腹泻病自1971年首次在英国暴发以来，相继在比利时、德国、匈牙利、瑞士等许多欧洲国家也都暴发了PED。在1978年英国和比利时首次报道分离得到该病的病毒，确诊了PEDV的感染。随后，20世纪80年代，日本、韩国、中国等一些亚洲国家暴发了猪腹泻病，经荧光抗体试验和血清中和试验诊断为PEDV感染而导致的猪腹泻。我国在1976年首次报道PED[10]的发生。在20世纪80年代我国就不断的有PED的发生，该病在我国26个省市自治区都有发生。近年来，本病的流行区域有逐渐扩大的趋势。目前，PED已成为我国养猪业重要的腹泻病之一。为了解福建省散养户非免疫猪猪流行性腹泻的感染情况,本实验运用酶联免疫吸附测定法(Enzyme—LinkedImmunosorbentAssay，ELISA)，对福建省散养户猪场的断奶仔猪的流行性腹泻进行检测，现将结果报导如下。22材料与方法2.1材料2.1.1仪器酶标仪、洗板机、离心机、振荡器、恒温培养箱、100μL单孔移液枪、eppendorf100μL八孔移液枪、1.5mL离心管、DYNEX96孔微平板、4℃冰箱、艾柯纯水机、V型加样槽等。2.1.2试剂PBS-TweenBuffer、双蒸水、HRPConjugateDilutionBuffer、HRPConjugateConcentrate、阳性对照血清、阴性对照血清、Anti-PRCVSolution、SubstrateSolution、StopSolution；2.1.3被检血清来自福建省9地市散户猪场断奶仔猪血样264份，所检测猪均未注射流行性腹泻疫苗。2.2方法2.2.1待检血清处理将待检血样室温血液自然凝固10-20min，通过离心机离心20min左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，提取血清成份，移入1.5mL离心管，并进行编号，于4℃冰箱中保存。2.2.2溶液配制PBS-TweenBuffer用纯水作20倍稀释，如配制500mL/板，在475mL中加入25mLPBST溶液，混匀。用HRPConjugateDilutionBuffer稀释HRPConjugateConcentrateConcentrate。最终浓度为1：750，混匀，现配现用。2.2.3操作步骤（1）所有试剂在使用前应回温（18-25℃）（2）未加入样品前，用PBS-Tween溶液洗板3次。每次让洗液在板中停留1min，最后一次时将板烘干。（3）加入100μL阳性对照血清（A和C），100μL阴性对照血清（B）。（见表1）（4）除对照孔外，每孔加入50μLPBS-Tween以及50μL待检血清。3（5）轻微振荡反应板，贴膜密封，于37℃温箱中孵育2h。（6）用PBS-Tween溶液洗板3次，烘干。（7）加入100μLAnti-PRCVSolution至样品反应孔中。（8）用贴膜密封反应板，再在室温下孵育30min。（9）用PBS-Tween溶液洗板3次，烘干。（10）每孔加入100μLdilutedHRPconjugageSolution，贴膜密封，室温下孵育30min。（11）用PBS-Tween溶液洗板3次，烘干。（12）每孔加入100μLSubstrateSolution，贴膜密封，从加入第一孔时开始计时，避光室温下孵育30min。（13）终止反应：按步骤12的加样顺序，每孔直接加入50μLStopSolution终止反应。轻微振荡混匀。（14）读板：450nm，在加完终止液后15min内读板。表1-1样品排布表123456A阳性A样品5样品13样品22样品30样品38B阴性B样品6样品14样品23样品31样品39C阴性B样品7样品15样品24样品32样品40D阳性C样品8样品16样品25样品33样品41E样品1样品9样品17样品26样品34样品42F样品2样品10样品18样品27样品35样品43G样品3样品11样品19样品28样品36样品44H样品4样品12样品20样品29样品37样品452.2.4结果判定OD阴性对照平均值-OD样品or阳性对照平均值OD阳性对照平均值当PI60时，结果为阳性（+）当PI45时，结果为阴性（-）当PI在45-60之间时，结果可疑（+-）3结果3.1PED检测结果采用酶联免疫吸附法进行猪流行性腹泻检测，经酶标仪分析，当PI60时，结果为阳性，用（+）表示。当PI45时，结果为阴性，用（-）表示。当PI在45-60之间时，结果可疑，用（+-）表示。264份血清检测结果如表2-7。PI=100×4表1-2一号板实验结果value123456A+++-+-+-B++-+-C++-++D+++++E++++++F++++++G++++++H+++++-注:第1列ABCD分别为阳性对照，阴性对照，阳性对照，阴性对照。以下各表同。表1-3二号板实验结果value123456A--+++B-++++C-++++D-++++E--+--++F--+-+++G-+--++-H-+++++-表1-4三号板实验结果value123456A--+++B+-++-C+--+++D+-+++-E+++++-F-+-+++-G+-+++-H-+-+-++-5表1-5四号板实验结果value123456A--+--B--+--C--++-+-D++++-+-E-+++--F-++++--G--++--H--++--表1-6五号板实验结果value123456A-+--+B-+--+C-+--+D-+--+E--+--+F--+--+G--+--+H--+--+表1-7六号板实验结果value123456A-+---B-+----C-+----D-+----E------F-++---G--+----H-+----63.2PED阳性率对待检的264份非免疫断奶仔猪血清检测结果进行统计，结果表明有125份PED呈阳性，阳性率为47.35%。有118份PED呈阴性，阴性率为44.70%。有21份PED可