论文刘春芳补肾方对激素性股骨头坏死大鼠的骨修复作用

1中国中医药研究促进会交稿补肾方对激素性股骨头坏死大鼠的骨修复作用刘春芳1，王慧1，姜宜妮1，汪倩倩1，郭秋岩1，林娜1*，陈卫衡2*（1.中国中医科学院中药研究所，北京100700；2.中国中医科学院望京医院，北京100102）[摘要]目的：观察补肾方对激素性股骨头坏死(SONFH)大鼠股骨头骨修复的作用。方法：采用单纯性糖皮质激素股骨头坏死模型大鼠，分别给予5.3、10.6和21.2g·kg-1的补肾方和1.68g·kg-1健骨生丸治疗，6周后取血和股骨头，HE染色观察股骨头组织病理学改变，Micro-CT扫描观察股骨头骨形态变化并进行骨计量学分析，股骨头血管造影Micro-CT扫描观察股骨头微循环（血管）变化并进行血管参数分析，旋转法进行血液流变学检测，酶速率法检测血清中血脂含量，ELISA检测血清骨形成标志物骨钙素(BGP)和降钙素(CT)含量。结果：10.6和21.2g·kg-1剂量的补肾方明显降低SONFH大鼠股骨头骨小梁狭窄或断裂、骨髓腔坏死、脂肪细胞增多变大等组织病理学和股骨头塌陷、骨质减少、骨小梁稀疏等影像学改变程度，升高BV/TV、Tb.Th、Tb.Pf、Tb.N、BMD并降低Tb.Sp，增加股骨头内血管数量和面积，降低全血粘度低切、中切值及血浆粘度和血清TG、TC、LDL和ApoA1含量的同时，升高血清HDL、ApoA1、BGP和CT含量，其中10.6g·kg-1剂量组的作用与健骨生丸相当。结论：补肾方能明显降低SONFH大鼠股骨头组织病理学和影像学改变程度，改善微循环（血管）、血液流变学和血脂异常变化，增加血清中BGP及CT含量；这一促进骨修复的作用可能是其防治激素引起的股骨头骨坏死的机制之一。[关键词]激素性股骨头坏死；补肾方；骨组织形态；骨计量；骨钙素；降钙素[基金项目]国家自然科学基金面上项目(81173417，81373656)[第一作者]刘春芳，博士，副研究员，从事中药药理研究，Tel:[phone]，E-mail:[e-mail][通讯作者]*陈卫衡，博士，主任医师，教授，博士生导师，北京地区百名优秀青年医师，新世纪百千万人才工程国家级人选，国务院政府特殊津贴专家，从事骨关节疾病的临床与基础研究，Tel:[phone]，E-mail:[e-mail]；林娜，博士，研究员，博士生导师，从事中药药性理论和中药药理研究，Tel:[phone]，E-mail:[e-mail]2激素性股骨头坏死(SONFH)是指因大剂量或长期使用激素而引起股骨头骨组织死亡的病理过程，其中骨坏死和骨修复与重建相伴发生[1]。中医将股骨头坏死归属于“骨痹”、“骨蚀”、“骨痿”范畴，认为激素性股骨头坏死是药毒损肾蚀骨的结果，患者多表现肾虚[2]，常采用补肾生髓、舒筋活络等方法进行治疗，取得一定疗效。补肾方具有补肾壮骨、活血通络功效，是笔者治疗股骨头坏死的系列临床经验方之一[3]。为了进一步了解其作用机制，本研究拟采用大鼠臀肌注射大剂量激素以造成实验性SONFH模型，观察补肾方对股骨头坏死骨修复的影响，为临床的合理应用提供实验参考。1.方法雄性Wistar大鼠随机分正常组（control）、模型组（model）、补肾方高、中、低剂量组（BS5.3、10.6和21.2g·kg-1）和阳性对照药健骨生丸组(JGS1.68g·kg-1)。除正常组外其余各组臀肌注射21mg·kg-1甲泼尼龙琥珀酸钠，一天一次，连续3天，建立单纯性糖皮质激素股骨头坏死模型。各给药组从第4d开始，分别给予5.3、10.6和21.2g·kg-1的补肾方和1.68g·kg-1健骨生丸，给药6周后取血和股骨头，HE染色观察股骨头组织的病理学改变，Micro-CT扫描观察股骨头骨形态变化并进行骨计量学分析，股骨头血管造影Micro-CT扫描观察股骨头微循环（血管）变化并进行血管参数分析，旋转法检测全血低切、中切、高切值以及血浆粘度检测，酶速率法检测血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)、载脂蛋白A1(ApoA1)、载脂蛋白B(ApoB)的含量，ELISA检测血清骨形成标志物骨钙素(BGP)和降钙素(CT)含量。2结果2.1对股骨头组织病理改变的影响组织病理形态学结果观察如图1显示，模型组股骨头部分软骨细胞排列不整齐，骨小梁变窄或断裂，骨细胞内可见大量空骨陷窝和核固缩，脂肪细胞明显增多变大；补肾方高剂量组股骨头软骨细胞规则尚整齐，骨小梁宽度较正常，未见明显断裂，骨细胞内有少量空骨陷窝，脂肪细胞面积和直径均明显低于模型组；健骨生丸组股骨头软骨细胞规则尚整齐，骨小梁宽度较正常，骨细胞内有少量空骨陷窝，脂肪细胞面积和直径均明显低于模型组。组织病理形态学半定量分析结果如表1所示，模型组空骨陷窝率、脂肪细胞3面积和直径较正常组均显著升高；经高、中剂量补肾方治疗后骨陷窝率、脂肪细胞面积和直径均显著降低；补肾方低剂量也能明显降低脂肪细胞面积；健骨生丸组也显著降低骨陷窝率、脂肪细胞面积和直径均显著降低，其作用与补肾方中剂量组相当。图1补肾方对SONFH大鼠股骨头组织病理改变的影响(HE，×200)注：A．Control；B.Model；C.BS21.2g/kg；D.JGS1.68g/kg表1补肾方对SONFH大鼠股骨头组织病理形态学半定量分析结果的影响(x±s，n=10)组别剂量/（g·kg-1）空骨陷窝率/%脂肪细胞面积/um2脂肪细胞直径/umControlModelBSJGS－－5.310.621.21.6816.7±4.742.3±3.2###29.1±9.522.3±9.3*18.1±7.6**21.0±3.6*142.0±25.5477.7±44.8###424.6±63.1*387.5±92.3**217.3±65.6***346.4±88.6**21.7±2.157±6.1###48.2±9.740.3±9.3*22.3±55***37.1±7.6**注：与Control相比，##P0.01，###P0.001；与Model相比，*P0.05，**P0.01，***P0.001.（下同）2.2对股骨头骨组织影像学改变的影响Micro-CT二维和三维重建股骨头骨组织形态观察结果如图2所示，正常组股骨头外形完整，骨小梁结构致密、粗细均匀；模型组股骨头外形有塌陷，骨小梁结构明显疏松，粗细不均，骺板上区域骨质明显较少；补肾方高剂量组骨小梁结构比模型组致密、增粗，股骨头外形完整，骺板上区域骨质增多；健骨生丸组股骨头外形较完整，骨小梁结构尚致密，较模型组增粗，骺板上区域骨质增多。ABCD4股骨头骨计量学参数分析结果如图3所示，模型组体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁模式因子(Tb.Pf)、骨小梁数量(Tb.N)、骨密度(BMD)较正常组均显著降低而骨小梁分离度(Tb.Sp)显著升高；与模型组相比，补肾方三个剂量组和健骨生丸组均显著升高BV/TV、Tb.Th、Tb.Pf、Tb.N、BMD并降低Tb.Sp，且健骨生丸组与补肾方中剂量组作用相当。图2补肾方对SONFH大鼠股骨头影像学改变的影响(microCT)注：A1-D1.二维图；A2-D2.三维图；A1和A2.Control；B1和B2.Model；C1和C2.BS21.2g/kg；D1和D2.JGS1.68g/kgControlModelBS5.3g/kgBS10.6g/kgBS21.2g/kgJGS1.68g/kg04080120###********BV/TV(100%)ControlModelBS5.3g/kgBS10.6g/kgBS21.1g/kgJGS1.68g/kg0.00.10.20.30.4###********Tb.Th(mm)ControlModelBS5.3g/kgBS10.6g/kgBS21.2g/kgJGS1.68g/kg0204060###********Tb.Pf.(1/mm)ControlModelBS5.3g/kgBS10.6g/kgBS21.2g/kgJGS1.68g/kg04812###*********Tb.N(1/mm)ControlModelBS5.3g/kgBS10.6g/kgBS21.2g/kgJGS1.68g/kg02004006008001000###*********BMD(g/mm3)ControlModelBS5.3g/kgBS10.6g/kgBS21.2g/kgJGS1.68g/kg0.000.050.100.150.200.25###*********Tb.Sp(mm)图3补肾方对SONFH大鼠股骨头骨计量参数的影响（x±s，n=10）2.3对股骨头微循环（血管）的影响股骨头血管形态Micro-CT扫描结果如图4所示，正常组股骨头内血管微结构清晰，血管丰富成网状；模型组股骨头内血管微结构模糊不清，血管较少不成网状，与正常组相比明显变细减少且有断裂；补肾方高剂量组血管微结构较清晰，A1B1C1A2B2C2D1D25血管成网状；健骨生丸组血管微结构较清晰，血管成网状。股骨头血管参数分析如图5所示，与正常组相比，模型组血管体积、血管表面积、血管体积分数、血管厚度均显著降低；与模型组相比，补肾方高和中剂量组血管体积、血管表面积、血管体积分数、血管厚度均显著升高，健骨生丸组亦明显升高这些血管参数，且作用与补肾方中剂量组相当。图4补肾方对SONFH大鼠股骨头血管形态的影响（Micro-CT）注：A．Control；B.Model；C.BS21.2g/kg；D.JGS1.68g/kgControlModelBS5.3g/kgBS10.6g/kgBS21.2g/kgJGS1.68g/kg0.00.10.20.3##******血管体积（mm3）ControlModelBS5.3g/kgBS10.6g/kgBS21.2g/kgJGS1.68g/kg051015##****血管表面积（mm3）ControlModelBS5.3g/kgBS10.6g/kgBS21.2g/kgJGS1.68g/kg0.000.040.080.120.16##*******血管体积分数（%）ControlModelBS5.3g/kgBS10.6g/kgBS21.2g/kgJGS1.68g/kg0153045607590##******血管厚度（mm3）图5补肾方对SONFH大鼠股骨头血管参数的影响(x±s，n=10)2.4对血液流变学的影响如图6所示，模型组全血粘度低切、中切、高切值和血浆粘度较正常组均显著升高；与模型组相比，补肾方高和中剂量组全血粘度低切、中切值和血浆粘度均显著降低，全血粘度高切值无显著差异；健骨生丸组亦显著降低全血粘度低6切、中切值和血浆粘度，其作用与补肾方中剂量组相当。ControlModelBS5.3g/kgBS10.6g/kgBS21.2g/kgJGS1.68g/kg0204060##***全血粘度低切值（mpa.s）ControlModelBS5.3g/kgBS10.6g/kgBS21.2g/kgJGS1.68g/kg010203040##***全血粘度中切值（mpa.s）ControlModelBS5.3g/kgBS10.6g/kgBS21.2g/kgJGS1.68g/kg036912##全血粘度高切值（mpa.s）ControlModelBS5.3g/kgBS10.6g/kgBS21.2g/kgJGS1.68g/kg051015##****血浆粘度（mpa.s）图6补肾方对SONFH大鼠血液流变学的影响(x±s，n=10)2.5对血脂的影响如图7所示，与正常组相比，模型组大鼠血清TG、TC、LDL、ApoB均显著升高，HDL和ApoA1显著降低；与模型组相比，补肾方高和中剂量组TG、TC、LDL和ApoA1均降低，而HDL和Apo