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ICS11.220B43DB13河北省地方标准DB13/T2593—2017禽腺病毒4型PCR检测方法2017-11-22发布2017-12-22实施河北省质量技术监督局发布DB13/T2593—2017I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由河北农业大学提出。本标准起草单位：河北农业大学。本标准主要起草人：袁万哲、王建昌、孙继国、刘聚祥、李丽敏、陈立功、李睿文、张磊、白云、陈赛娟、李杰峰。DB13/T2593—20171禽腺病毒4型PCR检测方法1范围本标准规定了禽腺病毒4型PCR检测方法的技术要求。本标准适用于检测家禽咽喉拭子、肛拭子，发病禽组织和这些采集样品培养物中的禽腺病毒4型。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1DNA脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）2.2EB溴化乙锭（ethidiumbromide）2.3PCR聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）2.4dNTP脱氧核苷酸三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）3试剂或材料包括各种市售病毒核酸提取试剂盒，1.0%琼脂糖凝胶，50×TAE缓冲液，溴化乙锭（EB，10ug/μL）或核酸染料，焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌的双蒸水，DNA分子量标准（100bp），2×TaqMasterMix或商品化的一步法PCR反应试剂。警示:电泳中用到的EB在操作中应戴手套和口罩。试验中被EB污染的物品要进行无害化处理；DEPC在操作中应在通风条件下进行，使用时戴手套和口罩，不小心沾到皮肤应立即冲洗。3.1病毒核酸提取试剂盒。3.21.0%琼脂糖凝胶，配制方法见附录A中A.1。3.350×TAE缓冲液，配制方法见附录A中A.2。3.4溴化乙锭（EB，10ug/μL）或核酸染料，配制方法见附录A中A.3。3.5焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌的双蒸水，配制方法见附录A中A.4。DB13/T2593—201723.6DNA分子量标准（100bp）:包含100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp几种分子量标准。3.72×TaqMasterMix。3.8商品化的一步法PCR反应试剂：含有PCR缓冲液、酶混合物、dNTP混合物、无RNA酶的水等。3.9引物：上游引物与下游引物见附录B中的表B.1。引物浓度为10μmol/L。4仪器设备4.1PCR仪：温度范围4.0℃～99.9℃；样品基座配置至少包括单个0.2mL孔。4.2凝胶成像系统：检测灵敏度DNA≥0.1ng；有效像数1360×1024、10bit、USB2.0。4.3台式低温高速离心机：最高转速16000r/min；容量1.5mL×12。4.4电泳仪：电压50V～120V，电流10mA～800mA，定时0min～999min。4.5电泳槽:耐高温、耐腐蚀、不漏液；缓冲液容量充足。4.6冰箱:具有冷藏功能。4.7微量移液器:单道可调；量程包括0.5～10μL、2～20μL、10～100μL、100～1000μL。4.8水浴锅:温度范围为室温～100℃。5样品5.1阴阳性对照以灭活的禽腺病毒4型鸡胚尿囊液作为阳性对照，以正常鸡胚尿囊液或者是正常家禽组织作为阴性对照。对照均应在-20℃保存。5.2样品的采集与处理5.2.1采集工具下列的采集工具应经121℃±2℃，20min高压灭菌并烘干：a)棉拭子；b)剪刀；c)镊子；d)1.5mL离心管；e)研钵。5.2.2棉拭子采集将棉拭子深入咽喉或肛门转一圈；将采集后的棉拭子放入盛有1.0mLPBS（配制方法见附录A中A.5）的1.5mL的离心管，加盖，编号。5.2.3组织采集DB13/T2593—20173剖检家禽，用剪刀采集心肝脾肺肾法氏囊等组织，装入一次性灭菌容器，编号。5.2.4样品储运样品采集后放入塑料袋内密封（一个采集点的样品放一个塑料袋内），于保温箱中加冰，密封24h内送至实验室。5.2.5样品的处理5.2.5.1棉拭子处理方法将装有棉拭子的离心管在混合器上充分混合后，用高压灭菌的镊子将拭子中的液体挤出，4℃条件下3000r/min离心15min，取上清液转入无菌的1.5mL离心管中，编号备用。5.2.5.2组织的处理方法将所采集的组织置于洁净、灭菌并烘干的搪瓷盘中，称取组织按照质量体积比（1:5）加入样品保存液进行充分研磨，4℃条件下3000r/min离心15min。取上清转入无菌的1.5mL的离心管备用，编号。6操作步骤6.1DNA的提取用病毒核酸提取试剂盒，按照如下步骤提取待检样品、阳性对照及阴性对照样品的DNA。6.1.1加入20μL蛋白酶K于1.5mL离心管中，在离心管中加入200μL样品，加入200μLBB5，涡旋混合15s，56℃孵育15min。6.1.2加入250μL无水乙醇，涡旋混合15s，室温放置5min。6.1.3将溶液和沉淀一起加入离心柱中，12000r/min离心1min，弃掉流出液。6.1.4加入500μLWB5,12000r/min离心1min，弃掉流出液，重复一次。6.1.5室温12000r/min离心1min，彻底去除残留的乙醇，在室温静置1min～3min彻底晾干离心柱。6.1.6将离心柱转入1.5mL离心管中，并向离心柱中央加20μLRNase-freeWater，室温静置1min。6.1.7室温12000r/min离心1min，洗脱DNA，-20℃贮存备用。6.2PCR在反应管中依次加入8μL无核酸酶水、10μL2×TaqMasterMix、1μL上述DNA溶液、0.5μL10µmol/L的上游引物、0.5μL10µmol/L的下游引物，最终至总体积为20μL。经充分混匀后瞬时离心，使液体全部聚集于管底。PCR扩增条件：94℃预变性3min，94℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸57s，循环30次；72℃延伸5min。扩增反应结束后立即进行电泳或置于4℃条件下备用。7试验数据处理DB13/T2593—201747.1扩增产物的电泳检测制备1.0%琼脂糖凝胶板。在电泳槽内加入1×TAE电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。取3μL～5μL扩增产物加到凝胶孔，加入DNA分子量标准（100bp）。恒压（110V）电泳30min～40min，将电泳好的凝胶放到凝胶成像系统上观察结果。7.2结果判定阳性对照的扩增产物经电泳检测，在预期大小的条带位置均出现特异性的条带；阴性的扩增产物没有预期的目的条带；阴阳性同时成立表明试验有效，否则试验无效。在试验结果成立的前提下，如果样品的PCR产物电泳后在954bp位置出现特异性的条带，则判定为禽腺病毒4型核酸检测阳性；如果样品的PCR产物电泳后在954bp位置未出现特异性的条带，则判定为禽腺病毒4型核酸检测阴性。PCR产物电泳图见附录C中C.1。8试验报告依次陈述试验对象、所使用的标准（包括发布或出版年号）、所使用的方法、检测结果、与试验时间等。DB13/T2593—20175附录A（规范性附录）相关试剂的配制A.11.0%琼脂糖凝胶称取琼脂糖1.0g，放入100mL1×TAE电泳缓冲液中，加热融化，温度降至60℃时，加入5μL核酸染料，均匀铺板，厚度为3mm～5mm。A.250×TAE电泳缓冲液A.2.10.5mol/LEDTA溶液（pH8.0）称取EDTA18.61g，加灭菌双蒸水至100mL，后用氢氧化钠调pH至8.0。A.2.2TAE电泳缓冲液（50×）Tris242g，冰乙酸57.1mL，0.5mol/LEDTA100mL，加灭菌双蒸水至1000mL。A.3溴化乙锭（EB）溶液溴化乙锭20mg，加灭菌双蒸水至20mL。A.4DEPC水焦碳酸二乙酯（DEPC）50μL，加灭菌双蒸水至100mL，室温放置6h～8h，121℃±2℃高压灭菌20min，分装到1.5mLDEPC处理过的离心管。A.5PBS缓冲液A.5.1A液（0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液）：NaH2PO4·H2O27.6g先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至1000mL。A.5.2B液（0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液）：Na2HPO4·7H2O53.6g，（或Na2HPO4·127H2O71.6g或Na2HPO4·2H2O35.6g）先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至1000mL。A.5.30.01mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液的配制：A液14mL，B液36mL，加氯化钠（NaCl）8.5g，最后用蒸馏水稀释至1000mL。DB13/T2593—20176附录B（规范性附录）引物表B.1规定了上游引物和下游引物的浓度和序列。表B.1上游引物和下游引物的浓度和序列引物名称引物浓度序列（5'-3'）上游引物10μmol/LCCGACCGTTACAAGTTTAGCAT上游引物10μmol/LTTCGCAGGAAGTCGTAGTGGADB13/T2593—20177附录C（规范性附录）禽腺病毒4型PCR产物电泳图说明：M——DNA分子量标准（100bp）；1——阳性对照；2——阴性对照。图C.1禽腺病毒4型PCR产物电泳图_________________________________