DB15T 1458-2018 青贮饲料pH值、有机酸、氨态氮测定方法

ICS65.020.01B05备案号：59997-2018DB15内蒙古自治区地方标准DB15/T1458—2018青贮饲料pH值、有机酸、氨态氮测定方法DeterminationofpHvalue,organicacidandammoniumnitrogeninsilage2018-07-25发布2018-10-25实施内蒙古自治区质量技术监督局发布DB15/T1458—2018I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由中国农业科学院草原研究所提出。本标准由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/T19）归口。本标准起草单位：中国农业科学院草原研究所、内蒙古自治区农牧业科学院、沈阳农业大学、中国农业大学、中国农业科学院科技管理局。本标准主要起草人：孙娟娟、阿拉木斯、薛艳林、白春生、赵金梅、玉柱、任卫波、武自念、刘振虎、刘洪林、常春、吴洪新、卫媛、尹强、李薇。DB15/T1458—20181青贮饲料pH值、有机酸、氨态氮测定方法1范围本标准规定了以水为浸提剂，采用电位法测定青贮饲料pH值、采用高效液相色谱法测定青贮饲料中有机酸（乳酸、乙酸、丙酸、丁酸）含量、采用比色法测定青贮饲料中氨态氮含量的方法。本标准适用于青贮饲料中pH值、有机酸含量、氨态氮含量的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB5009.237食品安全国家标准食品pH值的测定GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T2129饲草产品抽样技术规程3浸提液制备及保存3.1按照NY/T2129的规定，抽取青贮饲料样品。3.2取青贮样品20.00g，加入180mL的蒸馏水，或青贮饲料与水的质量体积比为1：9。经高速粉碎机（5000r/min）粉碎匀浆1min，先后通过四层纱布和定性滤纸过滤、分装。3.3pH值在浸提液制备后及时测定，有机酸和氨态氮在浸提液制备后24h内测定完毕。4pH值的测定4.1方法电位法。4.2原理当把pH计玻璃电极和甘汞电极插入青贮饲料浸提液时，构成一电池反应，两者之间产生电位差的大小决定于浸提液中的氢离子活度，其负对数即为pH值。4.3试剂和材料所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级以上水。4.3.1试剂4.3.1.1邻苯二甲酸氢钾（C6H4CO2HCO2K）。DB15/T1458—201824.3.1.2磷酸二氢钾（KH2PO4）。4.3.1.3磷酸氢二钠（Na2HPO4）。4.3.2pH标准缓冲液配置4.3.2.1pH=4.00的缓冲液，参照GB5009.237中的3.2.2。4.3.2.2pH=6.88的缓冲液，参照GB5009.237中的3.2.5。4.3.2.3配置好的pH标准缓冲液贮存于密闭的聚乙烯瓶中，可稳定一个月，发现有浑浊、发霉或沉淀等现象时，不能继续使用。不同温度下各标准缓冲溶液的pH见附录A。4.4仪器和设备4.4.1pH计：精度高于0.1单位。4.4.2电极：玻璃电极和饱和甘汞电极，或pH复合电极。4.4.3磁力搅拌器。4.4.4电子天平：感量0.01g。4.5分析步骤4.5.1pH计的校正4.5.1.1依照仪器说明书，用中性和酸性两种pH标准缓冲溶液进行pH计的校正。将盛有缓冲溶液并内置搅拌子的烧杯置于磁力搅拌器上，开启磁力搅拌器。4.5.1.2用温度计测量缓冲溶液，并将pH计的温度补偿旋钮调节到该温度上。有自动温度补偿功能的仪器，此步骤可省略。4.5.1.3搅拌平稳后将电极插入缓冲液中，读数稳定后读取pH值。4.5.2浸提液pH值的测定浸提液的温度与标准缓冲溶液的温度之差不超过1℃。pH值测量时，充分搅拌或摇动浸提液后，将电极插入试样溶液中，读数稳定后读取pH值。4.6测定结果直接读取pH值，结果保留两位小数。4.7精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于0.1。不同实验室测定结果的绝对差值不大于0.2。5有机酸的测定5.1方法高效液相色谱法。DB15/T1458—201835.2原理根据根据浸提液中离子交换体和离子溶质的静电相互作用（排斥）进行分离，以保留时间定性，外标法定量。5.3试剂和材料试剂均为优级纯，水为GB/T6682规定的一级水。5.3.1试剂高氯酸（HClO4）。5.3.2试剂配置高氯酸溶液（3mmol/L）：称取高氯酸0.8493g，加水定容至2000mL，混匀。5.3.3标准品5.3.3.1乳酸标准品（CH3CHCOOH），纯度≥99%。5.3.3.2乙酸标准品（CH3COOH），纯度≥99%。5.3.3.3丙酸标准品（CH3CH2COOH），纯度≥99%。5.3.3.4丁酸标准品（CH3CH2CH2COOH），纯度≥99%。5.3.4标准溶液配置5.3.4.1乳酸标准储备溶液（10mg/mL）：称取按其纯度折算为100%质量的乳酸0.1g（精确到0.0001g），置于10mL容量瓶中，加超纯水至刻度，混匀，于4℃保存。5.3.4.2乙酸标准储备溶液（10mg/mL）：称取按其纯度折算为100%质量的乙酸0.1g（精确到0.0001g），置于10mL容量瓶中，加超纯水至刻度，混匀，于4℃保存。5.3.4.3丙酸标准储备溶液（5mg/mL）：称取按其纯度折算为100%质量的丙酸0.05g（精确到0.0001g），置于10mL容量瓶中，加超纯水至刻度，混匀，于4℃保存。5.3.4.4丁酸标准储备溶液（5mg/mL）：称取按其纯度折算为100%质量的丁酸0.05g（精确到0.0001g），置于10mL容量瓶中，加超纯水至刻度，混匀，于4℃保存。5.3.4.5乳酸、乙酸、丙酸、丁酸混合标准曲线工作液：分别吸取各单标储备溶液0.25mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL和2.5mL于6个10mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，混匀，于4℃保存。5.3.5材料离子排阻色谱柱。5.4仪器和设备5.4.1高效液相色谱仪，带二极管阵列检测器或紫外检测器。5.4.2天平：感量为0.0001g和0.01g。5.4.3玻璃砂芯真空过滤装置。DB15/T1458—201845.4.4水相型微孔滤膜：孔径≤0.45μm。5.4.5注射器。5.4.6水系针筒过滤器：孔径≤0.45μm。5.4.7超声波清洗机：用于流动相脱气。5.4.8台式高速离心机。5.5分析步骤5.5.1试样处理青贮饲料浸提液12000r/min离心3min，取上清液经水相滤膜过滤，注入高效液相色谱仪分析。5.5.2仪器参考条件5.5.2.1色谱柱：ShodexRsparkKC-811柱，8mm×300mm，或同等性能的色谱柱。5.5.2.2流动相：用3mmol的高氯酸溶液，经水相滤膜过滤，脱气。5.5.2.3柱温：50℃。5.5.2.4进样量：5μL。5.5.2.5检测波长：210nm。5.5.2.6流速：1mL/min。5.5.3标准曲线的制作将标准系列工作液分别注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰高或峰面积。以标准工作液的浓度为横坐标，以色谱峰高或峰面积为纵坐标，绘制标准曲线（标准图谱见附录B）。5.5.4试样溶液的测定将待测液注入高效液相色谱仪中，得到峰高或峰面积，根据标准曲线得到待测液中有机酸的浓度。5.6结果计算试样中的有机酸含量按式（1）计算：10001000)(mwmVCX………………………（1）式中：X——试样中有机酸的含量，单位为克每千克（g/kg）；C——由标准曲线求得试样溶液中某有机酸的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；V——制备青贮饲料浸提液时水的体积，单位为毫升（mL）；m——制备青贮饲料浸提液用青贮饲料质量，单位为克（g）；w——青贮饲料中水的质量分数；1000——换算系数。DB15/T1458—201855.7精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算数平均值的10%。6氨态氮的测定6.1方法比色法。6.2原理试样直接用水提取后，浸提液中NH4+在强碱性介质中与次氯酸盐和苯酚发生反应，生成水溶性染料靛酚蓝，其颜色深浅与溶液中的NH4+含量呈正比。6.3试剂和材料试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级以上用水。6.3.1试剂6.3.1.1亚硝基铁氰化钠（Na2Fe(CN)5NO·2H2O）。6.3.1.2苯酚溶液或结晶苯酚（C6H5OH）。6.3.1.3氢氧化钠（NaOH）。6.3.1.4磷酸氢二钠（Na2HPO4.7H2O）。6.3.1.5次氯酸钠（NaClO）。6.3.1.6硫酸铵（(NH4)2SO4）。6.3.2试剂配置6.3.2.1苯酚试剂将0.05g亚硝基铁氰化钠溶解在500mL蒸馏水中，再加入11mL苯酚溶液或9.9g结晶苯酚，混合均匀后定容到1000mL，贮藏于棕色试剂瓶中，低温避光保存。6.3.2.2次氯酸盐溶液将5.0g氢氧化钠溶解在700mL的蒸馏水中，再加入20.1g磷酸氢二钠，中火加热并不断搅拌至完全溶解。冷却后加入14.7mL含8.5%活性氯的次氯酸钠溶液并混匀，定容到1000mL，贮藏于棕色试剂瓶中，低温避光保存。6.3.2.3标准铵溶液称取0.6607g经100℃条件下烘干24h的(NH4)2SO4溶于蒸馏水中，定容至100mL，配制成0.1mol/L的铵储备液。将上述储备液稀释配制成1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mmol/L五种不同浓度梯度的标准液。6.4仪器6.4.1分光光度计：配1cm石英比色皿。DB15/T1458—201866.4.2天平：感量为0.0001g和0.01g。6.5分析步骤6.5.1标准曲线的制作取6个50mL容量瓶，分别吸取铵储备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL，定容。配制成1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mmol/L五种不同浓度梯度的标准工作液。取6支试管，分别向每支试管中加入50μL标准工作液，空白为50μL蒸馏水；向每支试管中加入2.5mL的苯酚试剂，摇匀；再向每支试管中加入2mL次氯酸钠试剂，混匀；将混合液在95℃水浴中加热显色反应5min；冷却后，在630nm波长下比色。以吸光度和标准液浓度为坐标轴绘制标准曲线。6.5.2试样溶液的测定向每支试管中加入50μL经适当倍数稀释的试样溶液，重复2次，空白为50μL蒸馏水。按标准曲线的检测步骤测定试样溶液的吸光度。样品的吸光度与标准曲线比较求出含量。6.6结果计算试样中氨态氮含量按式（1）计算：100018)(mnwmVCX………………………（1）式中：X——试样中氨态氮的含量，单位为克每千克（g/kg）；C——由标准曲线求得试样溶液中氨态氮的浓度，单位为毫摩尔每升（mmol/L）；V——制备青贮饲料浸提液时水的体积，单位为毫升（mL）；m——制备青贮饲料浸提液用青贮饲料质量，单位为克（g）；w——青贮饲料中水的质量分数；n——样品稀释倍数；1000——换算系数。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算数平均值表示，结果保留两位有效数字。6.7精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算数平均值的10%。DB15/T1458—20187AA附录A（规范性附录）不同温度下各标准缓冲溶液的pH值表A.1不同温度下各标准缓冲溶液的pH值温度邻苯二甲酸盐标准缓冲溶液磷酸盐标准缓冲溶液10℃4.006.9215℃4.006.9020℃4.006.8825℃4.016.8630℃4.016.85DB15/T1458—20188BB附录B（规范性附录）4种有机酸的标准色谱图a乳酸—2.626mg/mL、乙酸—2.553mg/mL、丙酸—1.213mg/mL、丁酸—1.177mg/mL图B.14中有机酸的标准色谱图_________________________________乳酸乙酸丙酸丁酸