DB15T 1594-2019 青贮饲料中微生物数量测定方法

ICS65.120B46DB15内蒙古自治区地方标准DB15/T1594—2019青贮饲料中微生物数量测定方法Codeformeasuringmicroorganismcountsinsilage2019-02-20发布2019-05-20实施内蒙古自治区市场监督管理局发布DB15/T1594—2019I目次前言................................................................................II1范围..............................................................................12规范性引用文件....................................................................13术语和定义........................................................................14方法..............................................................................25仪器设备..........................................................................26培养基和试剂......................................................................27测定程序..........................................................................38分析步骤..........................................................................39微生物数量计算....................................................................3附录A（资料性附录）培养基..........................................................4DB15/T1594—2019II前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由内蒙古自治区农牧业科学院提出。本标准由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。本标准起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古农业大学、中国农业科学院草原研究所、沈阳农业大学、内蒙古草都饲草料研究院、内蒙古自治区草原勘察规划院。本标准主要起草人：孙林、薛艳林、格根图、张福金、殷国梅、孙杰、赵和平、孙娟娟、白春生、王志军、羿静、张欣昕、刘广华、范文强、张园园、刘思博、张琼琳。DB15/T1594—20191青贮饲料中微生物数量测定方法1范围本标准规定了青贮饲料中乳酸菌、大肠杆菌、细菌、霉菌和酵母菌数量测定的方法、仪器设备、培养基和试剂、测定程序、分析步骤、数量计算。本标准适用于内蒙古地区青贮饲料中微生物数量测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样3术语和定义3.1青贮饲料微生物microorganisminsilage青贮饲料中的乳酸菌、大肠杆菌、细菌、霉菌和酵母菌等微生物。3.2乳酸菌数量lacticacidbacteriacount青贮饲料样品经过处理，在一定的培养成分、温度和时间下培养后，所得1g试样中所含乳酸菌数量。3.3大肠杆菌数量coliformbacteriacount青贮饲料样品经过处理，在一定的培养成分、温度和时间下培养后，所得1g试样中所含大肠杆菌的数量。3.4细菌数量bacteriacount青贮饲料样品经过处理，在一定的培养成分、温度和时间下培养后，所得1g试样中所含好氧细菌数量。DB15/T1594—201923.5霉菌数量mouldscount青贮饲料样品经过处理，在一定的培养成分、温度和时间下培养后，所得1g试样中含霉菌数量。3.6酵母菌数量yeastscount青贮饲料样品经过处理，在一定的培养成分、温度和时间下培养后，所得1g试样中含酵母菌数量。3.7菌落形成单位colony-formingunits，CFU在琼脂平板上经过一定温度和时间培养后形成的每一个菌落，是计算微生物数量的单位。4方法根据青贮饲料中微生物生理特性，选择分别适宜于真菌、细菌、大肠杆菌和乳酸菌生长的培养基，采用平板计数方法，测定微生物数量。5仪器设备5.1分析天平，感量0.001g。5.2恒温培养箱：36℃±1℃。5.3高压灭菌器：灭菌压力0-3kg/cm2。5.4振荡器：往复式。5.5涡旋震荡器：2900r/min。5.6灭菌玻璃三角瓶：250mL，500mL。5.7灭菌试管：15mm×150mm。5.8灭菌培养皿：直径90mm。5.9灭菌吸管：1mL，10mL。5.10灭菌玻璃珠：直径5mm。5.11水浴锅：（45～77）℃±1℃。5.12超净工作台。6培养基和试剂6.1乳酸菌培养基：MRS琼脂，见附件A.1。6.2大肠杆菌培养基：结晶紫中性红胆盐琼脂，见附件A.2。6.3细菌培养基：营养琼脂，见附件A.3。6.4霉菌培养基：马铃薯葡萄糖琼脂，见附件A.4。6.5酵母菌培养基：马铃薯葡萄糖琼脂，见附件A.4。6.6稀释液：称取氯化钠8.5g，溶于1000mL蒸馏水中，分装后，121℃高压灭菌30min。6.7除特殊注明，所用试剂均为分析纯；水符合GB/T6682三级水规格。DB15/T1594—201936.8实验室常用消毒试剂。7测定程序青贮饲料微生物数量测定程序图见图1。图1青贮饲料微生物数量测定程序图8分析步骤8.1按照GB/T14699.1中的规定执行，采样时注意样品的代表性和避免污染。8.2菌液制备以无菌操作称取25g青贮样品放入装有225mL灭菌稀释液的玻璃三角瓶中，封口后置振荡器上，振荡30min，即为1:10的菌液。8.3用灭菌吸管吸取1:10菌液10mL，注入灭菌试管中，置涡旋震荡器上混合3min，使微生物充分分散成单个细胞。8.4用灭菌吸管吸取8.3的菌液（1:10）1mL，注入含有9mL灭菌稀释液试管中，置涡旋震荡器上混合1min，此液为1:100菌液。8.5按照上述操作顺序作10倍递增稀释，每稀释一次，换用一支1mL灭菌吸管；根据对样品情况的估计，选择三个合适稀释度；吸取1mL所选稀释度菌液于灭菌培养皿中，每个稀释度作两个培养皿。8.6菌液移入培养皿后，应及时将凉至45℃至60℃的培养基注入培养皿约15mL并转动培养皿使混合均匀。8.7待培养基凝固后，翻转培养皿，倒置于恒温（乳酸菌：30℃厌氧，大肠杆菌、细菌、霉菌和酵母菌：30℃）培养箱中，培养24h至96h（乳酸菌：72h，霉菌和酵母菌：96h，大肠杆菌：24h，细菌：96h）后开始观测计数。8.8选取乳酸菌、大肠杆菌、细菌或酵母菌等菌落数在30CFU～300CFU之间的培养皿进行计数，选取霉菌菌落数在10CFU～100CFU之间的培养皿进行计数；每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。9微生物数量计算青贮饲料中乳酸菌、大肠杆菌、细菌、霉菌和酵母菌数量按公式（1）计算：N=(C×10n-1×250)/25…………………………………………（1）式中:N——每克青贮饲料中微生物数量，单位为CFU/g；C——相同稀释度两个培养皿上菌落数的平均值；n——稀释度。DB15/T1594—20194AA附录A（资料性附录）培养基A.1MRS琼脂A.1.1成分蛋白胨10.0g牛肉粉5.0g酵母粉4.0g葡萄糖20.0g吐温801.0mLK2HPO4•7H2O2.0g醋酸钠•3H2O5.0g柠檬酸三铵2.0gMgSO4•7H2O0.2gMnSO4•4H2O0.05g琼脂粉15.0gA.1.2制法将上述成分加入到1000mL蒸馏水中，加热溶解，调节pH至6.2±0.2，分装后121℃高压灭菌15min。A.2结晶紫中性红胆盐琼脂A.2.1成分蛋白胨7.0g酵母膏粉3.0g乳糖10.0g氯化钠5.0g3号胆盐1.5g中性红0.03g结晶紫0.002g琼脂15.0gA.2.2制法将上述成分加入到1000mL蒸馏水中，煮沸不要超过2min，调节pH至pH7.4±0.2。DB15/T1594—20195A.3营养琼脂A.3.1成分蛋白胨10.0g牛肉粉3.0g氯化钠5.0g琼脂15.0gA.3.2制法将上述成分加入到1000mL蒸馏水中，加热溶解，调节pH至7.3±0.1，分装后121℃高压灭菌15min。A.4马铃薯葡萄糖琼脂A.4.1成分马铃薯200.0g葡萄糖20.0g琼脂20.0gA.4.2制法将上述成分加入到1000mL蒸馏水中，加热溶解，分装后121℃高压灭菌15min。_________________________________