DB21T 3094-2018 种猪场欧洲型猪蓝耳病净化技术规范

ICS11.220B41DB21辽宁省地方标准DB21/T3094—2018种猪场欧洲型猪蓝耳病净化技术规范Thetechnicalspecificationsforremovingeuropeangenotypeporcinereproductiveandrespiratorysyndromeinbreedingpigfarm2018-12-25发布2019-01-25实施辽宁省市场监督管理局发布DB21/T3094—2018I目次前言............................................................................II1范围..............................................................................12规范性引用文件....................................................................13术语和定义........................................................................13.1欧洲型猪蓝耳病................................................................13.2可疑感染猪群..................................................................13.3假定健康猪群..................................................................14净化群的建立......................................................................14.1采样数量和采样时间............................................................14.2检测方法......................................................................24.3处理..........................................................................35净化群的维持......................................................................45.1日常检测......................................................................45.2后备猪的检测..................................................................45.3引进猪只的检疫................................................................45.4病死猪的检测..................................................................46净化场的认定......................................................................47净化场的维持......................................................................47.1引进猪只的检疫................................................................47.2病死猪的检测..................................................................47.3人员和车辆等物品的消毒........................................................47.4场内及舍内环境的消毒..........................................................57.5无害化处理措施................................................................57.6杀虫防蝇灭鼠措施..............................................................5附录A（规范性附录）附录A..........................................................6DB21/T3094—2018II前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则并起草。本标准由辽宁省畜牧兽医局提出并归口。本标准起草单位：锦州医科大学、辽宁省动物卫生监测预警中心、锦州市动物疫病预防控制中心等单位。本标准主要起草人：李冰、刘全、高慎阳、刘英姿、陈勇、李宁、张建平、马强、赵岩、田苗、张娜、夏伟、邵奎龙、路畅、李红伟、郭雪峰、孙洪广、刘宏艳、李强、刘晓宇、王军、徐畅、何礼。DB21/T3094—20181种猪场欧洲型猪蓝耳病净化技术规范1范围本标准规定了种猪场欧洲型猪蓝耳病净化的术语和定义、检测方法与判定标准、净化群的建立、净化群的维持、净化场的认定和净化场的维持。本标准适用于种猪场欧洲型猪蓝耳病净化工作。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T27517鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RT-PCR方法GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB16548病害动物和病害动物产品生物安全处理规程NY/T1168畜禽粪便无害化处理技术规范3术语和定义3.1欧洲型猪蓝耳病欧洲型猪蓝耳病（EuropeanGenotypePorcineReproductiveandRespiratorySyndrome；EU-PRRS）：由欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒引起猪的一种高度接触性传染病，该病不但引起猪只免疫抑制，母猪流产，也可引起仔猪死亡，同时影响高致病性猪蓝耳病的防控工作，是世界上危害养猪业最严重的传染病之一。3.2可疑感染猪群可疑感染猪群（Suspiciouslyinfectedswineherd）：未发现任何症状，但与患病猪群及其污染的环境有过明显接触的猪群，称为可疑感染猪群。3.3假定健康猪群假定健康猪群（Hypothesisofhealthyswineherd）：除了患病猪群和可疑感染猪群外，疫区其他易感猪群都属于假定健康猪群。4净化群的建立4.1采样数量和采样时间4.1.1假定健康猪群DB21/T3094—20182种公猪按100%比例采血，或同时按100%比例采集精液，连续采集2次，间隔14天。种母猪按25%比例采血，或同时采集活体扁桃体，连续采集2次，间隔14天。4.1.2可疑感染猪群种公猪、种母猪分别按100%比例采血，或同时按100%比例采集精液，连续采集2次，间隔14天。4.1.3感染猪群种公猪、种母猪、后备猪分别按100%比例采血，或同时按100%比例采集精液，连续采集2次，间隔14天。4.2检测方法4.2.1检测试剂和仪器本技术规范中使用的试剂，除另有说明外，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无RNA酶的容器分装，水为符合GB/T6682-1992标准的灭菌双蒸水或超纯水。本技术规范中需应用下列试剂和材料：Trizol（RNA抽提试剂，外观为粉红色，分装至棕色瓶中，于4℃～8℃保存）、氯仿（4℃预冷）、异丙醇（4℃预冷）、75%乙醇（用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，－20℃预冷）、DEPC水（1000mL双蒸水中加入1mLDEPC，室温下持续搅拌过夜，121℃高压灭菌25min）、RNA酶抑制剂（40U/μL）、TaqDNA聚合酶（5U/μL）、dNTP(2.5mmol/L)、AMV反转录酶（5U/μL）、三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液（TAE）、溴化乙锭（EB）、DL2000DNAMarker、上游引物：5ˊ-TAACCGAGCATACGCTGTGAGAAAG-3ˊ，下游引物：5ˊ-CAAATTAACTTGCACCCTGACTGGC-3ˊ。本技术规范中使用的设备包括：PCR扩增仪，高速冷冻离心机（离心力在12000g以上），核酸电泳仪和水平电泳槽，组织均浆机或研钵，凝胶成像系统、微量移液器。4.2.2样品的采集与处理4.2.2.1组织样品：按照GB/T27517标准中关于组织样品处理方法执行。采集时应釆取有明显病变的淋巴结、扁桃体、肺脏、脾脏、肾脏、胸腺等组织样品。用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品0.5g左右于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，再加0.3mL～0.5mLPBS混匀，然后将组织悬液转入无菌Eppendorf管中，4℃条件下5000r/min离心10min，取上清液转入新的无菌Eppendorf管中，编号备用。4.2.2.2血清或抗凝血：用无菌注射器自耳静脉或前腔静脉釆集血液3mL～5mL，待血清析出后直接吸取血清至无菌Eppendorf管中，血清量不少于0.5mL，编号备用；用无菌注射器先吸入抗凝剂（阿氏液）2mL～3mL，再自耳静脉或前腔静脉采集等量血液快速混匀后转入无菌Eppendorf管中，编号备用。4.2.2.3存放与运送：采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。采集或处理的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融。4.2.2.4RNA提取及cDNA合成：按照Trizol提取试剂说明书提取总RNA，按照反转录试剂盒说明书进行转录合成cDNA，－20℃保存待检。4.2.2.5RT-PCR扩增DB21/T3094—20183表1RT-PCR反应体系（总体积25µL）反应体系最佳剂量DEPC水13.5µL2.5mmol/LdNTP2µL10µmol/L上游引物1µL10µmol/L下游引物1µL25mmol/L氯化镁溶液1.5µL10倍PCR缓冲液2.5µL5U/µLTaqDNA聚合酶0.5µLcDNA3µL总体积25µL反应条件：预变性95℃3min；变性94℃30s，退火温度58℃30s，72℃30s，35个循环；总延伸72℃10min。4.2.2.6电泳：将PCR扩增产物8µL与2µL上样缓冲液混合，加样于1%琼脂糖凝胶孔中，琼脂糖凝胶板一侧点样孔加入DL2000MarkDNA分子质量标准物。以5V/cm电压电泳30min，用紫外凝胶成像仪观察结果。4.2.2.7结果判定被检样品电泳出现519bp扩增带为欧洲型PRRSV阳性，详见图1。图1欧洲型PRRSV阳性毒株PCR电泳图注：M,DNA分子量标准（DL2000Marker）；1,阴性对照；2,PRRSV欧洲型毒株阳性对照。4.3处理欧洲型猪蓝耳病病毒核酸检测阳性者，应淘汰处理。在最后1头阳性猪淘汰后3个月，对种公猪按100%比例、母猪按25%比例采血或同时按相同比例采集活体猪扁桃体样品，再次进行欧洲型猪蓝耳病病毒核酸检测。欧洲型猪蓝耳病病毒核酸检测全部阴性，可视为假定欧洲型猪蓝耳病阴性猪群。DB21/T3094—201845净化群的维持5.1日常检测每年对假定欧洲型猪蓝耳病阴性种猪群进行3～4次抽检。每次采集血清或活体扁桃体样品，抽样比例为存栏种猪的25%～35%。应在连续12个月内，对所有6月龄以上