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ICS65.020.30B41备案号：35742-2013DB22吉林省地方标准DB22/T1608—2012牛病毒性腹泻/粘膜病病毒荧光RT-PCR检测方法Methodofthereal-timeRT-PCRforthedetectionofBovineviraldiarrhea/mucosaldisease2012-12-01发布2013-01-01实施吉林省质量技术监督局发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T1608—2012I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局技术中心。本标准主要起草人：孟庆峰、王伟利、吴连鹏、王玮琳、肖成蕊、蔡阳、宋战昀、孟日增。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T1608—20121牛病毒性腹泻/粘膜病病毒荧光RT-PCR检测方法1范围本标准规定了牛病毒性腹泻/粘膜病病毒（bovineviraldiarrhea/mucosaldisease，BVDV）荧光RT-PCR检测方法。本标准适用于牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。Ct值：达到阈值的循环数（CycleThreshold）DEPC：焦碳酸乙二酯（Diethylpyrocarbonate）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）RNA：核糖核酸（RibonucleicAcid）荧光RT-PCR：荧光逆转录聚合酶链反应（RealTimeFluorescentQuantitativeReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction）4原理采用TaqMan方法，比对牛病毒性腹泻/粘膜病病毒基因组5'端非编码区最保守的核苷酸序列，设计特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针5'端标记FAM荧光素为报告荧光基团（用R表示），3'端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团（用Q表示），它在近距离内能吸收5'端荧光基因发出的荧光信号。PCR反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基因所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶的5'到3'的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。5试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。5.1试剂本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T1608—201225.1.1水：配制方法见附录A.1。5.1.2Catrimox-14(Cat-14)。5.1.3酚。5.1.4三氯甲烷。5.1.5柠檬酸钠。5.1.6正丁醇。5.1.7乙酸钠。5.1.8乙醇。5.1.9异丙醇（-20℃预冷）。5.1.10其他试剂：AMV反转录酶(5U/μL)、RnaseInhibitor(40U/μL)、10×AMVRTPCRbuffer、MgCL2(25mM)、dNTPMixture(各10mM)、EX-Taq酶(5U/μL)。5.1.11引物：根据病毒性腹泻/粘膜病病毒（BVDV）国际标准株基因序列设计合成一对特异性引物：上游引物5'-CCATGCCCTTAGTAGGACTAGCA-3'，下游引物5'-AACCACTGACGACTACCCTGTACT-3'，TaqMan探针（FAM）5'-CCATCCAACGAACTCACCACTGTTGC-3'（TAMRA）均配制成20umol/L，-20℃保存。5.2对照样品的制备5.2.1阳性对照样品由指定单位提供或下列方法制备：将牛病毒性腹泻粘膜病国际标准毒株按10%接种原代牛睾丸细胞，于37℃吸附1h后加入维持液（见附录A.2），37℃培养，待CPE达到70%时收获病毒悬液，冻融2次～3次，5000r/min离心10min，取上清液备用。5.2.2阴性对照样品由指定单位提供或下列方法制备：将生长良好的原代睾丸细胞，冻融2次-3次，5000r/min离心10min，取上清液备用。6仪器6.1荧光PCR检测仪。6.2高速台式冷冻离心机（最高可达13000r/min）。6.3微量移液器：0.5μL～10μL，5μL～20μL，20μL～200μL，100μL～1000μL。6.4组织匀浆器。6.5混匀器。6.6二氧化碳培养箱。7操作步骤7.1样本的处理7.1.1组织样品：包括肠粘膜刮取物、肾、肝、肺、淋巴结、脾、胸腺。取2g～5g组织样品切成小块，加5mL～15mL预冷的Hanks平衡盐溶液匀浆2min，制成悬液，4℃5000r/min离心取150μL上清液加入1mLCat-14振荡混匀。7.1.2液体样品：包括血清、血液（加柠檬酸盐、EDTA、肝素等）、各种拭子（鼻腔、气管和眼）、精液。7.1.2.1含EDTA的血液：取50μL加装有1mL1×SSC（见附录A.3章）溶液的离心管中，混匀，4℃12000r/min，离心1min，倒掉上清液，将沉淀物重新悬浮于残留液中，加入500μLCat-14振荡混匀。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T1608—201237.1.2.2含柠檬酸钠或肝素的血液：取50μL加入500μLCat-14振荡混匀。7.1.2.3血清、精液、各种拭子悬液等液体样品：取100μL加入500μLCat-14振荡混匀。7.1.2.4阴性和阳性对照样品：分别取100μL加入500μLCat-14振荡混匀。7.2样本RNA的提取7.2.1将7.1中各种处理物立即震荡30s，室温放置10min～30min,4℃12000r/min，离心5min，倒置于吸水纸上，吸去液体，瞬时离心5s，用带滤芯的吸头吸干残留液体，将沉淀溶于200μLGITC（见附录A.4）缓冲液里，间歇振荡5min，置于冰上。7.2.2将7.2.1中悬浮物用100μL水饱和酚和100μL预冷的含2%正丁醇的三氯甲烷进行抽提，振荡30s，4℃12000r/min，离心5min；取上清液加入100μL预冷（-20℃）的含2%正丁醇的三氯甲烷振荡30s，4℃12000r/min，离心5min，取上清液。7.2.3上清液加入300μL异丙醇，-70℃冻存0.5h，或者-20℃至少1h。7.2.4取出后4℃12000r/min，离心5min，用500μL80%乙醇漂洗，再用500μL100%预冷（-20℃）的乙醇漂洗。干燥后加入50μLDEPC水，溶解RNA，轻轻混匀，2000r/min离心5s。冰上保存备用，若放置-70℃可长期保存。7.3荧光RT-PCR反应7.3.1反应体系用漩涡混匀器将表1中各组分混匀后瞬间离心，备用。表1荧光PCR反应体系成分用量（μL）10×AMVRTPCRbuffer2.5MgCL2(25mM)5.0DntpMixture(各10mM)2.5RnaseInhibitor(40U/μL)0.5AMV反转录酶(5U/μL)0.5EX-Taq酶(5U/μL)0.5上游引物(20μmol/L)0.5下游引物(20μmol/L)0.5探针(20μmol/L)0.5待检RNA模板5.0RnaseFreedH2O7.0总计25.07.3.2反应参数将7.3.1中离心后的PCR管放入荧光RT-PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。循环参数设置如下：——第一阶段，反转录42℃30min；——第二阶段，预变性92℃3min；——第三阶段，92℃10s、45℃30s、72℃1min，5个循环；——第四阶段，92℃10s、60℃33s，35个循环，荧光收集设置在第四阶段每次循环的退火延伸时进行。8结果判定本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T1608—201248.1结果分析条件设定读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。8.2质控标准8.2.1阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。8.2.2阳性对照的Ct值应≤28，并出现特定的扩增曲线。8.2.3如阴性对照和阳性对照条件不满足以上条件，此实验视为无效。8.3结果描述及判定8.3.1阴性判定无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无牛病毒性腹泻/粘膜病病毒核酸。8.3.2阳性判定Ct值≤30，且出现特定的扩增曲线，表示样品中存在牛病毒性腹泻/粘膜病病毒核酸。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T1608—20125AA附录A（规范性附录）试剂配制A.1DEPC处理的双蒸水及离心管、吸头处理方法1000mL双蒸馏水加1mLDEPC，室温放置24h以上，0.105Mpa蒸汽高压30min。4℃或室温保存。离心管、吸头应放在0.1%DEPC水中浸泡24h以上，取出烘干DEPC水后再121℃高压灭菌30min，晾干后使用。A.2维持液DMEM培养基内含青霉素200IU/mL，链霉素200IU/mL，抽滤除菌。A.31×SSC溶液0.15mol/L氯化钠（NaCl）、15mmol/L柠檬酸钠、pH7。A.4GITC缓冲液4mol/L异硫氰酸胍、0.2mol/L乙酸钠（pH4）、0.1mol/L2-巯基乙醇。B_________________________________本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印