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ICS65.020.20B05备案号：54204-2017DB22吉林省地方标准DB22/T2527—2016转基因玉米中cry1A基因定性检测PCR法Qualitativedetectionforcry1Agenesingeneticallymodifiedmaize—PCRmethod2016-12-09发布2017-03-01实施吉林省质量技术监督局发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2527—2016I前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林省农业委员会提出并归口。本标准起草单位：吉林省农业科学院。本标准主要起草人：李飞武、邵改革、夏蔚、闫伟、董立明、李葱葱。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2527—20161转基因玉米中cry1A基因定性检测PCR法1范围本标准规定了转基因玉米中cry1A基因定性检测PCR法的术语和定义、原理、试剂或材料、试验条件、仪器设备、样品、试验步骤、结果分析与表述、检出限。本标准适用于转基因玉米MON810、MON89034、Bt11、Bt176、Bt506、C0030.3.5、双抗12-5转化体及其衍生品种的植株、籽粒及以玉米为唯一原料的玉米初加工品中的cry1A基因的普通PCR定性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求农业部1485号公告—4—2010转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化农业部1861号公告—3—2012转基因植物及其产品成分检测玉米内标准基因定性PCR方法农业部2031号公告—19—2013转基因植物及其产品成分检测抽样3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1zSSIIb基因zSSIIbgene编码玉米淀粉合酶异构体zSTSII-2的基因，在本标准中作为玉米的内标准基因。3.2cry1A基因cry1Agene编码苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）Cry1A杀虫晶体蛋白的一类基因。4原理根据转基因玉米中cry1A基因保守序列设计特异性引物，对试样进行PCR扩增。依据是否扩增获得预期330bp的DNA片段，判断样品中是否含有cry1A基因成分。5试验条件常温条件下。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2527—201626试剂或材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水。6.1琼脂糖。6.210g/L溴化乙锭（EB）溶液：称取1.0g溴化乙锭，溶解于100mL水中，避光保存。警告——溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。注：可选择其他的核酸染料代替溴化乙锭作为核酸电泳的染色剂。6.310mol/L氢氧化钠（NaOH）溶液：在160mL水中加入80.0g氢氧化钠，溶解后，冷却至室温，再加水定容到200mL。6.4500mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液（pH8.0）：称取18.6g乙二胺四乙酸二钠，加入70mL水中，缓慢滴加氢氧化钠溶液（6.3）直至EDTA-Na2完全溶解，用氢氧化钠溶液（6.3）调pH至8.0，加水定容至100mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。6.51mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）溶液（pH8.0）：称取121.1g三羟甲基氨基甲烷溶解于800mL水中，用盐酸调pH至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。6.6TE缓冲液（pH8.0）：分别量取10mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（6.5）和2mL乙二胺四乙酸二钠溶液（6.4），加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。6.750×TAE缓冲液：称取242.2g三羟甲基氨基甲烷（Tris），先用500mL水加热搅拌溶解后，加入100mL乙二胺四乙酸二钠溶液（6.4），用冰乙酸调pH至8.0，然后加水定容到1000mL。使用时用水稀释成1×TAE。6.8加样缓冲液：称取250.0mg溴酚蓝，加入10mL水，在室温下溶解12h；称取250.0mg二甲基苯腈蓝，加10mL水溶解；称取50.0g蔗糖，加30mL水溶解。混合以上三种溶液，加水定容至100mL，在4℃下保存。6.9DNA分子量标准：可以清楚的区分100bp～1000bp的DNA片段。6.10dNTPs混合溶液：将浓度为10mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合。6.11TaqDNA聚合酶、PCR反应缓冲液及25mmol/L氯化镁溶液。6.12zSSIIb基因引物：按农业部1861号公告—3—2012中给出的普通PCR引物：zSSIIb-F：5’-CTCCCAATCCTTTGACATCTGC-3’zSSIIb-R：5’-TCGATTTCTCTCTTGGTGACAGG-3’注：预期扩增片段大小为151bp。6.13cry1A基因特异性序列引物：Cry1A-F：5’-ACCGGYTACACYCCCATCGACATC-3’Cry1A-R：5’-GGCGSWGTTCATGTCGTTGAA-3’注1：预期扩增片段大小为330bp。注2：Y表示碱基C或T，S表示碱基C或G，W表示碱基A或T。6.14引物溶液：用TE缓冲液（6.6）或水分别将上述引物稀释到10µmol/L。6.15DNA提取试剂盒。6.16定性PCR试剂盒。7仪器设备本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2527—201637.1PCR扩增仪：升降温速度＞1.5℃/s，孔间温度差异＜1.0℃。7.2凝胶成像系统或照相系统。7.3电泳槽、电泳仪等电泳装置。7.4紫外透射仪。7.5分析天平：感量0.1g和0.1mg。8样品8.1抽样按NY/T672和农业部2031号公告—19—2013的规定执行。8.2试样制备按NY/T672和农业部2031号公告—19—2013的规定执行。8.3试样预处理按农业部1485号公告—4—2010的规定执行。9试验步骤9.1DNA模板制备按农业部1485号公告—4—2010的规定执行。9.2PCR扩增9.2.1试样PCR扩增9.2.1.1玉米内标准基因PCR扩增按农业部1861号公告—3—2012中7.5.1.1.1的规定执行。9.2.1.2cry1A基因PCR扩增9.2.1.2.1每个试样PCR设置3次平行。9.2.1.2.2在PCR管中按表1依次加入反应试剂，混匀。也可采用经验证的、等效的定性PCR试剂盒配制反应体系。表1PCR检测反应体系试剂终浓度体积水—10×PCR缓冲液1×2.5µL25mmol/L氯化镁溶液1.5mmol/L1.5µLdNTPs混合溶液（各2.5mmol/L）各0.2mmol/L2.0µL10µmol/LCry1A-F0.2µmol/L0.5µL10µmol/LCry1A-R0.2µmol/L0.5µL本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2527—20164表1续试剂终浓度体积TaqDNA聚合酶0.025U/µL—25mg/LDNA模板2.0mg/L2.0µL总体积25.0µL注1：“—”表示体积不确定，如果PCR缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，根据TaqDNA聚合酶的浓度确定其体积，并相应调整水的体积，使反应体系总体积达到25.0µL。注2：若采用定性PCR试剂盒，则按试剂盒说明书的推荐用量配制反应体系，但上下游引物用量按表1执行。9.2.1.2.3将PCR管放在离心机上，500g~3000g离心10s，然后取出PCR管，放入PCR仪中。9.2.1.2.4进行PCR反应。反应程序为：94℃变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35次循环；72℃延伸7min。9.2.1.2.5反应结束后取出PCR管，对PCR反应产物进行电泳检测。9.2.2对照PCR扩增9.2.2.1在试样PCR扩增的同时，应设置PCR阴性对照、PCR阳性对照和PCR空白对照。9.2.2.2以非转基因玉米基因组DNA作为阴性对照的模板；以转cry1A基因玉米质量分数为0.1%~1.0%的玉米基因组DNA溶液作为阳性对照的模板；以水作为空白对照的模板。9.2.2.3除模板外，对照PCR扩增与试样PCR扩增相同。9.3PCR产物电泳检测按20g/L的质量浓度称量琼脂糖，加入1×TAE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。每100mL琼脂糖溶液中加入5µLEB溶液或适量的核酸染料，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入1×TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取10µLPCR产物与2µL加样缓冲液混合后加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准，接通电源在2V/cm~5V/cm条件下电泳检测。9.4凝胶成像分析电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。10结果分析与表述10.1对照检测结果分析阳性对照PCR中，玉米内标准基因和cry1A基因序列得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而阴性对照中仅扩增出玉米内标准基因片段，空白对照中没有预期扩增片段，表明PCR检测反应体系正常工作。否则，重新检测。10.2样品检测结果分析和表述本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2527—2016510.2.1玉米内标准基因和cry1A基因序列均得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，表明样品中检测出cry1A基因成分，表述为“样品中检测出cry1A基因成分，检测结果为阳性”。10.2.2玉米内标准基因片段得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而cry1A基因序列未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，表明样品中未检测出cry1A基因成分，表述为“样品中未检测出cry1A基因成分，检测结果为阴性”。10.2.3玉米内标准基因片段未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，表明样品中未检出玉米基因组DNA成分，结果表述为“样品中未检测出玉米基因组DNA成分，检测结果为阴性”。注：3次PCR平行扩增的结果不一致的，应重复检测。重复检测结果仍不一致的，以多数结果为最终结果。11检出限方法检出限为0.1%。注：方法检出限是以PCR检测反应体系中加入50ngDNA模板进行测算的。_____________________________本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印