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ICS11.220B41备案号：54236-2017DB22吉林省地方标准DB22/T2559—2016牛新孢子虫病检测方法LAMP法LAMPassayfordetectionofbovineNeosporaosis2016-12-09发布2017-03-01实施吉林省质量技术监督局发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2559—2016I前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：延边大学、吉林省动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：贾立军、柴方红、张守发、梁晚枫。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2559—20161牛新孢子虫病检测方法LAMP法1范围本标准规定了牛新孢子虫病LAMP检测方法的技术要求。本标准适用于牛新孢子虫病病原检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件3.1新孢子虫病Neosporiasis由犬新孢子虫(Neosporacaninum)引起的多种动物的一种原虫病，该病主要引起母畜的流产、死胎或新生胎儿的运动障碍和神经系统疾病。3.2环介导等温扩增(LAMP)Loop-mediatedisothermalamplification针对靶基因的6个区域设计4种特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件下(63℃左右)保温30min～60min，使得链置换DNA合成在不停地自我循环，即而完成的核酸扩增反应。4试剂除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。4.1常规试剂4.1.1100mg/mL溶菌酶见附录A.1。4.1.210mg/mL蛋白酶K见附录A.2。4.1.310%十二烷基磺酸钠见附录A.3。4.1.45%十六烷基三甲基溴化铵见附录A.4。4.1.5TE（pH8.0）见附录A.5。4.1.650×TAE缓冲液见附录A.6。4.1.7加样缓冲液见附录A.7。4.1.81.5%琼脂糖凝胶的制备见附录A.8。4.2分子生物学试剂本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2559—20162BstDNAPolymerase、SYBRGreenⅠ、限制性内切酶TaqⅡ、组织DNA提取试剂盒、血液DNA提取试剂盒、溴化乙锭、DNAMarker分子量标准等。使用或稀释时均参照试剂说明书进行。4.3引物表1LAMP特异性引物序列及浓度引物引物序列引物浓度F3ATGCTTGTGTGGTGAGGC0.2µmol/LB3CAAGTGCCACCCACTGATC0.2µmol/LFIPCGCTGACCGATCGGTTAACTGATTGCCAAACTCAGTGCGT1.6µmol/LBIPTTAGCAGTTGGGGTGTCGGGTACCCTGTTTCGGGAGACA1.6µmol/L4.4标准阳性、阴性对照4.4.1标准阳性样品为犬新孢子虫基因组DNA提取物，DNA浓度为10mg～30mg。制备方法见附录B。4.4.2标准阴性样品健康牛组织DNA提取物，DNA浓度为10mg～30mg。5仪器设备5.1低温高速离心机（12000g以上）。5.2恒温水浴锅（室温～100℃）5.3分析天平（感量0.1mg）5.4电泳槽（水平电泳槽）5.5电泳仪（电压1～300V；电流1～400mA）5.6凝胶成像系统（带紫外灯）5.7微量加样器（单道2μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL）5.8其它分子生物学实验设备（振荡器、小型离心机等）6试验步骤6.1样品采集无菌采集流产胎牛脑、肝、脾、肺等组织样品，或牛的血液样品，置灭菌1.5mL塑料离心管中，进行样品处理；或冷冻保存，备用。6.2样品处理待检样品组织DNA或血液DNA的提取，按试剂盒说明书进行。6.3LAMP反应LAMP反应体系：总体系25µL。同时设置阳性对照、阴性对照和水对照。LAMP反应条件：63℃反应60min，80℃2min终止反应。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2559—20163表2LAMP反应体系加样物浓度体积DNA模板10～30mg2µLMgSO46.0mmol/L3µLdNTP1.4mmol/L3.5µLF30.2µmol/L1µLB30.2µmol/L1µLFIP1.6µmol/L1µLBIP1.6µmol/L1µLBstDNAPolymeraseBuffer10×2.5µLBstDNAPolymerase8U/µL1µLddH2O9µL总体系25µL6.4结果判定6.4.1眼观判定将样品反应物加入1000×SYBRGreenI2µL，室温放置10min，置于凝胶成像仪的紫外灯下观察。阳性对照样品应呈现绿色荧光，阴性对照与水对照样品应呈现棕色、无荧光。在对照成立的前提下，样品呈现绿色荧光判为阳性，呈现棕色、无荧光判为阴性。具体参考标准见附录C.1。6.4.2电泳判定取样品反应物2µL加入到1.5%琼脂凝胶板的样品孔中，并设置标准阳性、阴性和标准分子量DNAMarker。将凝胶在150V恒定电压下电泳30min后，置于凝胶成像仪观察。阳性样品应呈现特征性梯状条带，阴性与水对照样品无条带。具体参考标准见附录C.2。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2559—20164AA附录A（规范性附录）环介导等温扩增（LAMP）常用溶液配制A.1100mg/mL溶菌酶表A.1100mg/mL溶菌酶溶菌酶100mg灭菌双蒸水定容至1mLA.210mg/mL蛋白酶K表A.210mg/mL蛋白酶K蛋白酶K10mg灭菌双蒸水定容至1mLA.310%十二烷基磺酸钠（SDS）表A.310%十二烷基磺酸钠（SDS）十二烷基磺酸钠（SDS）10g灭菌双蒸水定容至100mL注：分装，灭菌，室温保存。A.45%十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）表A.45%十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）0.5g灭菌双蒸水定容至10mLA.5TE（pH8.0）10mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)与1mmol/L的EDTA（pH8.0）等体积混合，高压灭菌。A.650×TAE缓冲液本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2559—20165A.6.10.5mol/L乙二铵四乙酸（EDTA）（pH8.0）表A.50.5mol/L乙二铵四乙酸（EDTA）（pH8.0）乙二铵四乙酸二钠18.6g灭菌双蒸水80mL注：用氢氧化钠溶液调pH至8.0，灭菌双蒸水定容至100mL。A.6.2TAE缓冲液（50×）配制表A.6TAE缓冲液（50×）配制三羟甲基氨基甲烷（Tris）24.2g冰乙酸5.71mL0.5mol/L乙二铵四乙酸（EDTA）（pH8.0）10mL注：加去离子水定容至100mL，室温保存备用，使用时稀释50×为工作液。A.7加样缓冲液表A.7加样缓冲液溴酚蓝10mg甘油2.5mL0.5mol/LpH6.8三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液定容至10mLA.81.5%琼脂糖凝胶的制备表A.81.5%琼脂糖凝胶的制备琼脂糖1.5g1×TAE缓冲液定容至100mL将三角瓶放在沸水浴或微波炉中加热至琼脂糖充分溶解（注意用微波炉加热时不要沸出），置室温冷却到50℃左右，加入10mg/mL的溴化乙锭10μL，摇匀，倒入电泳板上，凝固后取下梳子，4℃备用。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2559—20166BB附录B（规范性附录）标准阳性对照模板DNA制备B.1取体外培养收集的犬新孢子虫悬液150µL加入1.5mL离心管中，加入溶菌酶（100mg/mL）15µL，充分混匀，37℃下1h。B.2依次加入蛋白酶K(10mg/ml)9µL、10%SDS105µL、5mol/LNaCl150µL、5%CTAB240µL，充分混匀后，65℃下10min。B.3加入等体积Tris-饱和酚和氯仿反复抽提两次，氯仿洗涤一次。B.4取上层于另一1.5mL离心管中，加入等体积无水乙醇和1/10体积醋酸钠沉淀30min。B.54℃下12000r/min离心15min，弃上清。B.6将70%乙醇100µL沿管壁徐徐加入，4℃下12000r/min离心1min，吸弃上清，干燥。B.7用20µLTE溶解DNA，取一部分测定OD260和OD280，计算所提的DNA浓度和纯度，其余基因组总DNA于-20℃保存、备用。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2559—20161CC附录C（规范性附录）LAMP扩增结果判定标准C.1眼观判定LAMP扩增标准：12图C.1LAMP扩增后加入SYBRGreenI紫外灯下眼观结果注1：标准阳性对照注2：标准阴性对照C.2电泳判定LAMP扩增标准：图C.2LAMP扩增电泳结果M:DL2000DNAMarker；注1：标准阳性对照注2：标准阴性对照_________________________________本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印