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ICS11.220B41备案号：56317-2017DB22吉林省地方标准DB22/T2704—2017牛卵形巴贝斯虫病检测方法PCR法PCRassayfordetectionofbovineBabesiaovata2017-09-30发布2017-11-30实施吉林省质量技术监督局发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2704—2017I前言本标准按照GB/T1.1—2009和GB/T20001.4—2015给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：延边大学、吉林省动物疫病预防控制中心、延边朝鲜族自治州畜牧总站。本标准主要起草人：贾立军、梁晚枫、柴方红、黄国明、张魁、王海军。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2704—20171牛卵形巴贝斯虫病检测方法PCR法1范围本标准规定了牛卵形巴贝斯虫病PCR检测方法的技术要求。本标准适用于牛卵形巴贝斯虫病原检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义3.1卵形巴贝斯虫病babesiosis由牛卵形巴贝斯虫（Babesiaovata）寄生于牛的红细胞内，以高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿等为主要特征的血液寄生虫病。4原理双链DNA在高温加热的作用下变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则，通过人工合成的特异性寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链，再利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸(dNTPs)合成新生的DNA互补链，进而完成特定片段的体外扩增。5试剂和溶液除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。5.1试剂5.1.1TaqDNA聚合酶。5.1.2dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）。5.1.3血液DNA提取试剂盒。5.1.4DNAMarker分子量标准。5.2常规试剂配制5.2.150×TAE缓冲液见附录A.1。5.2.2加样缓冲液见附录A.2。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2704—201725.2.310mg/mL溴化乙锭见附录A.3。5.2.41%琼脂凝胶见附录A.4。5.3引物PCR反应引物序列与浓度见表1。表1PCR反应引物序列与浓度引物引物序列DNA序列长度/bp浓度/pmol/μL上游引物5’-GCCCGCAGGTCATCATAAAGT-3’下游引物5’-CATTTTGTGCCAGCGTTTTG-3’AB367928.11008105.4仪器设备5.4.1PCR扩增仪,温度范围：4℃～100℃。5.4.2低温高速离心机,12000r/min以上。5.4.3高压灭菌器,120℃以上。5.4.4恒温水浴锅,室温～100℃。5.4.5分析天平,感量0.1mg。5.4.6电泳槽,水平电泳槽。5.4.7电泳仪,电压1V～300V；电流1mA～400mA。5.4.8凝胶成像系统,带紫外灯。5.4.9微量加样器,单道2μL、10μL、20μL、100μL和200μL。5.5试验样品对无菌采集的待检牛血液样品，封装于洁净塑料离心管或玻璃试管内，编号。冷藏条件下送实验室检测。6试验步骤6.1模板DNA制备按血液基因组DNA提取试剂盒操作说明书提取模板DNA见附录B。6.2检测血样PCR反应在PCR反应管中按表2依次加入反应试剂，反应体系为25µL。反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性50s，50℃退火60s，72℃延伸50s，循环30次；72℃延伸7min，4℃保存。表2PCR检测反应体系试剂体积10×PCR缓冲液2.5µL2.5mmol/LdNTP2.0µL表2（续）本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2704—20173试剂体积10µmol/L上游引物1.0µL10µmol/L下游引物1.0µL5U/µLTaq酶0.25µL25mg/LDNA模板2.0µL灭菌双蒸水16.25µL总体积25µL6.3对照PCR反应在试样PCR反应的同时，设置标准阴性对照、标准阳性对照和空白对照，各对照PCR反应体系中，除模板外其余组分及PCR反应条件与6.2相同。以未感染卵形巴贝斯虫牛血液中提取的DNA作为标准阴性对照PCR反应体系的模板；以卵形巴贝斯虫感染牛的血液提取的DNA作为标准阳性对照PCR反应体系的模板；以无菌双蒸水作为空白对照PCR反应体系的模板。7结果判定7.1标准对照标准对照见附录C。7.2检测样品判定将所有样品、标准阳性对照、标准阴性对照及空白对照的PCR产物按编号加入到1%琼脂凝胶板的各孔中，将凝胶的边孔中加入标准分子量DNAMarker，将凝胶在150V恒定电压下电泳30min后，凝胶成像仪观察结果，判定如下：a)在凝胶成像仪下，标准阴、阳性对照成立，若待检样品出现1008bp的DNA带，判为阳性，记作“+”，若无此带，记为“－”；b)若标准阴、阳性对照不成立，则全部样品应重新检测。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2704—20174AA附录A（规范性附录）聚合酶链式反应（PCR）试验常用试剂配制A.150×TAE缓冲液A.1.10.5mol/L乙二铵四乙酸（EDTA）（pH8.0）的配制见表A.1。表A.10.5mol/L乙二铵四乙酸（EDTA）（pH8.0）乙二铵四乙酸二钠18.6g灭菌双蒸水80mL氢氧化钠调pH至8.0灭菌双蒸水定容至100mLA.1.2TAE缓冲液（50×）的配制见表A.2。表A.2TAE缓冲液（50×）配制三羟甲基氨基甲烷（Tris）242g冰乙酸57.1mL0.5mol/L乙二铵四乙酸（EDTA）（pH8.0）10mL注：加去离子水定容至100mL，室温保存备用，使用时稀释50×为工作液。A.2加样缓冲液加样缓冲液的配制见表A.3。表A.3加样缓冲液溴酚蓝10mg甘油2.5mL0.5mol/LpH6.8的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液定容至10mLA.310mg/mL溴化乙锭10mg/mL溴化乙锭的的配制见表A.4。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2704—20175表A.410mg/mL溴化乙锭溴化乙锭0.1g水（H2O）定容至10mLA.41%琼脂糖凝胶1%琼脂糖凝胶的制备见表A.5。表A.51%琼脂糖凝胶的制备琼脂糖1g1×TAE缓冲液定容至100mL将三角瓶放在沸水浴或微波炉中加热至琼脂糖充分溶解（注意用微波炉加热时不要沸出），置室温冷却到50℃左右，加入10mg/mL溴化乙锭10μL，摇匀，倒入电泳板上，凝固后，4℃备用。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2704—20176BB附录B（规范性附录）样品DNA的制备DNA提取试剂盒步骤：a)在检测样品中加入2倍～3倍体积的红细胞裂解液，充分颠倒混匀，12000r/min离心1min，吸去上清，沉淀为白色或淡红色。向沉淀中加200μL溶液A，振荡至彻底混匀；b)向悬浮液中加入20μL（10mg/mL）的RNaseA，充分颠倒混匀，室温放置10min；c)加入20μL（10mg/mL）的蛋白酶K，充分颠倒混匀，65℃水浴消化30min～60min，消化期间可颠倒离心管混匀数次，直至样品消化完全为止；d)加入2倍体积溶液B（已加入无水乙醇），充分颠倒混匀，将溶液加入吸附柱中，室温放置2min；e)12000r/min离心2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中；f)向吸附柱中加入700μL漂洗液（使用前加入无水乙醇），12000r/min离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中；g)向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000r/min离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。h)12000r/min离心2min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟；i)将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50μL～200μL经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，12000r/min离心1min；j)离心所得洗脱液再加入吸附柱中，12000r/min离心2min，即可得到高质量的基因组DNA；k)取一部分测定OD260和OD280，以计算所提的DNA浓度和纯度，其余基因组总DNA于4℃保存。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2704—20177CC附录C（规范性附录）标准对照标准对照见图C.1。M123说明：M——DL2000DNAMarker；1——标准阴性对照；2——标准阳性对照；3——空白对照。图C.1PCR扩增标准阳性、阴性对照______________________DE2000bp1000bp500bp200bp1008bp本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印