DB22T 2921-2018 禽白血病ABJ亚群检测 PCR法

ICS11.220B41DB22吉林省地方标准DB22/T2921—2018禽白血病A/B/J亚群检测PCR法DetectionmethodofPCRofavianleukosisA,BandJ-subgroups2018-11-12发布2018-12-30实施吉林省市场监督管理厅发布DB22/T2921—2018I前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院。本标准主要起草人：曹利利、郭衍冰、董航、姚新华、苑淑贤、程荣华、邵洪泽。DB22/T2921—20181禽白血病A/B/J亚群检测PCR法1范围本标准规定了禽白血病A/B/J亚群PCR检测方法的技术要求。本标准适用于禽白血病A/B/J亚群的核酸检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其昀新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3试剂或材料3.1试剂3.1.1病毒基因组DNA提取试剂盒。3.1.2阳性对照，为禽白血病病毒基因组DNA，或含有上述片段的质粒标准分子DNA。3.1.3阴性对照，健康鸡血液或血清DNA。3.1.410×PCR缓冲液，见附录A.1。3.1.510mmol/LdNTPs。3.1.62U/μLTaqDNA聚合酶。3.1.7水为DEPC处理过的双重蒸馏水（ddH2O），符合GB/T6682的规定。3.1.850×TAE电泳缓冲液，见附录A.2。3.1.910mg/mL溴化乙锭（EB）溶液，见附录A.3或其他同类型可替代物。3.1.101.0%琼脂糖凝胶，见附录A.4。3.1.11上样缓冲液，见附录A.5。3.1.12标准分子量DL2000Marker。3.2材料3.2.110μL、200μL和1000μL吸头。3.2.21.5mL离心管。3.2.3无菌棉拭子。3.2.40.2mL薄壁PCR管。3.3引物引物序列、浓度及扩增长度见表1。DB22/T2921—20182表1引物序列及浓度引物引物序列使用浓度扩增长度上游引物F5′-GCCAAACGGATTTCTGCCTT-3′AR5′-AACCCAGATACCAAGGAACC-3′375bpBR5′-ACAGATGGACCAATTCTGTCTC-3′581bp下游引物JR5′-ATTGTTCCACAACACCTCTG-3′10μmol/L683bp4仪器设备4.1微量移液器，2.5μL、20μL、200μL、1000μL。4.2电子天平，感量0.1mg。4.3均质器。4.4低温高速离心机。4.5PCR扩增仪。4.6核酸电泳仪。4.7紫外凝胶成像仪。5样品5.1血液或血清样品的处理用移液器（4.1）吸取抗凝血液或血清样品500μL（3.2.1）于1.5mL的离心管（3.2.2）中，以病毒基因组DNA提取试剂盒（3.1.1）提取样本DNA，操作方法按说明书进行。5.2鸡胚尿囊液的处理用移液器吸取鸡胚尿囊液500μL于1.5mL的离心管中，以病毒基因组DNA提取试剂盒提取样本DNA，操作方法按说明书进行。5.3肿瘤或其他组织的处理称取（4.2）100mg肝脏、脾脏或胰腺等组织用均质器（4.3）研碎，以病毒基因组DNA提取试剂盒提取样本DNA，操作方法按说明书进行。5.4喉拭子和泄殖腔拭子的处理将喉拭子和/或泄殖腔拭子（3.2.3）置于1.5mL离心管中，以少量ddH2O浸润，用离心机（4.4）3000r/min离心15min，取上清液500μL于1.5mL离心管中，以病毒基因组DNA提取试剂盒提取样本DNA，操作方法按说明书进行。DB22/T2921—201836试验步骤6.1PCR扩增分别设立以ddH2O为模板的空白对照、阳性对照（3.1.2）、阴性对照（3.1.3）和待检样品，采用50μL反应体系，在0.2mL薄壁PCR管（3.2.4）中依次加入表2所示的试剂后，瞬时离心混匀，做好标记，于PCR仪（4.5）中扩增。表2PCR反应体系成分用量10×PCR缓冲液（3.1.4）5μLdNTPs（3.1.5）4μLTaqDNA聚合酶（3.1.6）1μL引物F（3.3）4μL引物AR（3.3）2μL引物BR（3.3）2μL引物JR（3.3）2μL模板（5）4μLddH2O（3.1.7）26μLPCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。6.2电泳6.2.1将适量50×TAE（3.1.8）稀释成1×TAE溶液，配制溴化乙锭（3.1.9）含量为0.5μg/mL的1.0%琼脂糖凝胶（3.1.10），见附录A.4。6.2.2取8μLPCR产物，与2μL上样缓冲液（3.1.11）混匀，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中。6.2.3加入标准分子量DL2000Marker（3.1.12）。6.2.4设置电泳仪（4.6）电压为5V/cm，电泳时间根据溴酚蓝的移动位置来确定。6.2.5用紫外凝胶成像仪（4.7）观察结果。7结果判定7.1当ALV-A、ALV-B及ALV-J阳性对照分别出现375bp、581bp及683bp扩增带，而空白对照和阴性对照未出现目的带时，实验结果成立。7.2当被检样品出现375bp、581bp或683bp扩增带，则分别判定为ALV-A、ALV-B或ALV-J亚群阳性，参见附录B，未出现相应扩增带的样品判为阴性。DB22/T2921—20184AA附录A（资料性附录）相关试剂配制A.110×PCR缓冲液10×PCR缓冲液配制见表A.1。表A.11mol/LTris-HCl（pH8.8）10.0mL1mol/LKC150.0mLNonidetP408.0mL1.5mol/LMgCl21.0mLddH2O加至1000.0mLA.250×TAE电泳缓冲液制备A.2.10.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液配制（pH8.0）见表A.2。表A.2二水乙二铵四乙酸二钠18.6gddH2O80.0mL氢氧化钠（1mol/LNaOH）调pH至8.0ddH2O加至100.0mLA.2.250×TAE电泳缓冲液配制见表A.3。表A.3三羟甲基氨基甲烷（Tris）242.0g冰乙酸57.1mL0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0）100.0mLddH2O加至1000.0mL作电泳液使用时，用ddH2O进行50倍稀释A.3溴化乙锭（EB）溶液配制溴化乙锭（EB）溶液见表A.4。DB22/T2921—20185表A.4溴化乙锭0.2gddH2O加至20.0mLA.41.0%琼脂糖凝胶板制备1.0%琼脂糖凝胶板制备见表A.5。表A.5琼脂糖1.0g50×TAE电泳缓冲液2.0mLddH2O98.0mL微波炉中完全融化，待冷却至50℃60℃时，加溴化乙锭（EB）溶液5μL后摇匀，倒入电泳板中，凝固后取下梳子，备用。A.5上样缓冲液上样缓冲液见表A.6。表A.6溴酚蓝0.2g蔗糖50.0gddH2O100mL溴酚蓝0.2g，加10mLddH2O溶解过夜。50g蔗糖加入50mLddH2O溶解后，移入已溶解的溴酚蓝溶液中，摇匀定容至100mL。DB22/T2921—20186BA.5B附录B（资料性附录）阳性对照PCR扩增结果A亚群标准阳性PCR扩增结果见图B.1。图B.1B亚群标准阳性PCR扩增结果见图B.2。图B.2DB22/T2921—20187J亚群标准阳性PCR扩增结果见图B.3。图B.3A、B、J亚群标准阳性PCR扩增结果见图B.4。图B.4_________________________________