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ICS65.020.99B22备案号：40485-2014江苏省地方标准DB32DB32/T2599-2013畜禽肠出血性大肠杆菌O157:H7的检测DetectionforenterohemorrhagicEscherichiacoliO157:H7inanimalsandpoultry2013-12-20发布2014-01-20实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T2599-2013前言为规范畜禽大肠杆菌O157:H7的检测，特制定本标准。本标准按GB/T1.1—2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》进行编制。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准起草人：张雪寒、何孔旺、叶青、李彬、倪艳秀、温立斌、周俊明、王小敏、俞正玉。DB32/T2599-20131畜禽肠出血性大肠杆菌O157:H7的检测1范围本标准规定了畜禽肠出血性大肠杆菌O157:H7的检测技术。本标准规定的细菌分离、血清学鉴定和LAMP适用于本病的确诊，ELISA和LAMP适用于大批量样品的普查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订单）适用于本文件。GB16548病害动物和病害动物产品生物安全处理规程GB/T4789.36食品卫生微生物学检验大肠埃希氏杆菌O157:H7/NM检验GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法NY/T541动物疫病实验室检验采样方法SN/T973进出口肉、肉制品及其他食品中肠出血性大肠杆菌O157:H7检测方法3流行病学诊断大肠杆菌O157:H7能够感染和定植所有温血动物，通过排泄物污染食物、水源和环境。这种排菌或带菌的无症状性大大增加了畜禽中肠出血性大肠杆菌0157:H7流行和传播的监控难度。夏季7-9月为高排菌季节，人类感染机会也会明显增多。4临床诊断在家畜家禽中，牛是主要的带菌动物，但成年牛一般不会发病，通常没有临床症状，只有犊牛才会出现腹泻。猪可产生水肿病，以头部，肠系膜和胃壁浆液性水肿为特征，常伴有共济失调，麻痹或惊厥等神经症状，发病率较低但致死率很高。死亡小鼠的病理剖检变化：可见整个肠道肠壁菲薄，透明肿大有气泡，出血充血，充满黄色液体，其中以十二指肠最严重；肝脏灰白色点状坏死，周边淤血；心、肺、脾、肾点状出血发点等。5病原学诊断5.1细菌分离5.1.1材料准备除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682—2008的灭菌二级水。含有新生霉素肉汤培养基（mEC）、改良麦康凯培养基（CT-SMAC）、改良CHROMagar（科玛嘉）培养基。5.1.2样品采集用无菌勺子采集新鲜粪便放置无菌培养管中。无菌刮取器从畜禽直肠内2-5cm区间刮取肠表皮组织，放置无菌培养管中。无菌刮取器在畜禽背部、腹部和臀部收集刮取物，放置无菌培养管中。DB32/T2599-201325.1.3样品增菌称取粪便样（肠组织）25g至无菌锥形瓶中，加入225mL无菌的生理盐水，37℃震荡2h，每个样品取10mL加入90ml含有新生霉素的EC肉汤（mEC）中，37℃继续震荡8h。或者直肠刮取物（距离肛门，直肠内2-5cm区间）和皮肤和羽毛表面刮取物至无菌锥形瓶中，加入10ml含有新生霉素的EC肉汤（mEC）中，37℃继续震荡8h。5.1.4全自动酶联荧光免疫分析仪的快速筛选参照GBT-4789.36-2008食品卫生微生物学检验大肠埃希氏杆菌O157:H7/NM检验第三法“全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法”进行试验。也可用其他类似商品化免仪器测定，使用方法和判定参照说明书进行。出现阳性结果时，在CT-SMAC平板和科玛嘉显色平板上对原增菌液进行如下步骤；如果结果为阴性，报告待检样品中未检测到肠出血性大肠杆菌O157:H7。5.1.5免疫磁珠免疫磁珠（Dynalbeadsanti-E.coliO157:H7）富集和分离5.1.5.1取出增菌液1mL于无菌的EP管中。5.1.5.2吸取20uLanti-O157:H7免疫磁珠试剂加入到含有1mL增菌液的无菌EP管中，颠倒混合后将离心管夹在微量混合器上，12rpm混合10min。5.1.5.3取下离心管，放入磁力架的孔中，静置3min，小心吸走管中液体。5.1.5.4取1mL洗脱缓冲液重悬磁珠。5.1.5.5将离心管颠倒混均5-8次，再置于磁力架中，静置3min，小心吸走多余液体。重复洗涤一次，最后加入50-100uL洗脱缓冲液重悬磁珠。5.1.5.6将洗脱缓冲液涂布于改良麦康凯（CT-SMAC）平板和改良CHROMagar平板，37℃恒温箱中培养18-24h。5.1.5.7也可用其他类似商品化免疫磁珠产品，使用方法和判定参照说明书进行。5.2细菌鉴定5.2.1菌落识别在CT-SMAC平板上，典型菌落为不发酵或者迟缓发酵山梨醇，圆形、光滑、较小的无色菌落，中心呈现较暗的灰褐色；发酵山梨醇的为红色；在改良CHROMagar平板上为圆形、较小的菌落，中心呈淡紫色-紫红色，边缘无色或浅灰色。5.2.2环介导等温扩增（LAMP）挑取可疑菌落5-10个，分别接种于100μLTE缓冲液中，振荡器打散菌落，沸水浴10分钟，离心后上清，即为LAMP模板。根据肠出血性大肠杆菌O157:H7的O抗原编码基因rfbE6个特异性区域设计4条引物：F3和B3为外引物；FIP和BIP为内引物。F3：5′-cgaaaacgtgaaattgctgat-3′；B3：5′-tacattggcatcgtgtgg-3；FIP：5′-tgagaccatccaataagtgtgaaaaaaatatcaacagtcttgtacaagtc-3′；BIP：5′-ctaggaccgcagaggaaagagtaaaaaactggccttgtttc-3′。外引物扩增产物为208bp。LAMP扩增产物在电泳图谱上表现为大小不一的梯状条带。LAMP扩增条件：65℃水浴锅中放置60min。优化后的反应体系中：1×Buffer（Tris-HCl20mM，Mg2+8mM，Tween-200.1%，KCl10mM，[NH4]2SO410mM，dNTPs1.4mM）12.5µL，内引物50µM和外引物5µM各1µL，BstDNA聚合酶8u，DNA5µL，补水至25µL。水浴结束后，加入钙黄绿素荧光染料，肉眼观察结果，绿色，判为阳性，橙色，判为阴性。或以1.5％琼脂糖凝胶电泳，出现梯状条带，判为阳性，无条带，判为阴性。5.3结果判定以上实验皆为阳性判定为肠出血性大肠杆菌O157:H7。5.4血清学试验DB32/T2599-20133参照GB/T4789.36-2008食品卫生微生物学检验大肠埃希氏杆菌O157:H7/NM检验5.4.1进行试验。5.5生化试验参照GB/T4789.36-2008食品卫生微生物学检验大肠埃希氏杆菌O157:H7/NM检验5.4.2进行试验。6最终结论判定下列任何情况之一，均可判为肠出血性大肠杆菌O157:H7阳性。6.1不分季节，新生幼崽个体临床表现明显，病例解剖病变典型，用第5章中任何一种试验确诊为肠出血大肠杆菌O157:H7阳性者。6.2有明显季节性，成年动物流动比较频繁，与排泄物密切接触，用第5章中任何一种试验确诊为肠出血大肠杆菌O157:H7阳性者。6.3流行病学、个体表现和病理变化不详，粪便样品、直肠刮取物、皮肤羽毛刮取物，用第5章中任何一种实验确诊为肠出血大肠杆菌O157:H7阳性者。