DB32T 3686-2019 山羊副流感病毒3型检测技术规程

ICS65.020.30B40江苏省地方标准DB32DB32/T3686—2019山羊副流感病毒3型检测技术规程TechnicalregulationsfordetectionofCaprineparainfluenzavirus32019-12-04发布2019-12-25实施江苏省市场监督管理局发布DB32/T3686—2019I前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由江苏省农业科学院提出并归口。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准主要起草人：李文良、毛立、李基棕、郝飞、刘茂军、杨蕾蕾、孙敏。DB32/T3686—20191山羊副流感病毒3型检测技术规程1范围本标准规定了山羊副流感病毒3型（Caprineparaifluenzavirus3,CPIV3）的病原学检测（病毒核酸的RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测）、血清学检测（血凝抑制（HI）试验）的技术要求。本标准适用于山羊副流感病毒3型及其感染情况的实验室检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3病原学检测3.1材料微量移液器及吸头、DEPC水处理的离心管、吸头、PCR扩增管、TRIzol试剂、三氯甲烷、异丙醇、DEPC处理水（用水符合GB/T6682规定）、反转录酶/TaqDNA聚合酶混合液、2×一步法RT-PCR反应缓冲液、一步法荧光定量RT-PCR试剂盒、TAE缓冲液、琼脂糖、核酸染料、引物MF/MR、引物qMF/qMR与探针（附录A）。3.2仪器设备PCR仪、荧光定量PCR仪、台式冷冻离心机、电泳仪和水平电泳槽、凝胶成相仪（或紫外透射仪）。3.3反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）3.3.1样品处理与RNA的提取采集羊的鼻拭子、气管拭子或肺脏（样品的采集、保存和运输应符合NY/T541相关规定）。取200μL待检样品液至无菌无RNA酶的EP管中，使用TRIzol试剂、RNA提取试剂盒或自动化核酸提取仪等方法提取RNA。3.3.2RT-PCR反应RT-PCR反应使用20μL体系：10μL2×一步法RT-PCR反应缓冲液、引物MF/MR各0.5μL（10μmol/L）、0.4μL反转录酶/TaqDNA聚合酶混合液、4μLRNA模板，4.6μLDEPC处理水。反应条件为：45℃反转录30min；94℃预变性2min；94℃30s，54℃30s，72℃30s，进行35个循环；72℃延伸10min。3.3.3结果判定取PCR产物10μL，在1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳，在凝胶成像系统中观察结果。样品PCR检测产物电泳后有大小为346bp的片段判断为山羊副流感病毒3型核酸阳性，无条带判断为阴性。每次试验应设置阴阳性对照，阴阳性对照应不出现或出现相应大小的条带。DB32/T3686—201923.4荧光定量反转录-聚合酶链式反应（荧光定量RT-PCR）3.4.1核酸提取与荧光定量RT-PCR反应核酸提取同3.3.1。荧光定量RT-PCR反应使用20μL体系：10μL2×一步法反应缓冲液，0.4μL反转录酶，0.4μLDNA聚合酶，引物qMF/qMR各0.4μL（10μmol/L），0.8μL探针，0.4μL染料，2μLRNA模板，5.2μLDEPC处理水。将PCR管置于荧光定量PCR仪器上进行RT-PCR扩增，程序如下：42℃5min；95℃10s；95℃5s，60℃34s，共进行40个循环。3.4.2荧光定量RT-PCR结果判定阳性对照扩增曲线呈标准的S曲线，且Ct值＜30。阴性对照扩增曲线应为基线下的水平线。若样本曲线呈S形曲线，且Ct值＜38为阳性；未出现扩增曲线为阴性。4血清学检测——血凝抑制（HI）试验4.1材料微量移液器及配套吸头、96孔V型微量反应板、生理盐水、1%豚鼠红细胞悬液（配制方法见附录B）、病毒液（相关试验操作应符合GB19489的要求）、标准阳性血清、标准阴性血清。4.2仪器设备离心机、恒温培养箱。4.3病毒血凝效价测定每次HI试验前应对病毒血凝效价进行测定，检测与判定方法如下：——在反应板一排各孔中加25μL生理盐水；——第一孔中加25μL病毒分离液，按照1:2倍比稀释，最后一孔不加抗原作阴性对照。每孔中再加25μLPBS；——每孔加25μL1%豚鼠红细胞液，37℃孵育40min；——当红细胞被凝集时，红细胞均匀分布在反应板底部，反应板倾斜片刻，红细胞不下滑；红细胞未被凝集时，反应板倾斜片刻，可见沉淀的红细胞向下滑动，形成流线。HA效价为全部红细胞出现凝集时的最高稀释倍数。4.4HI试验按如下方法进行HI试验：——在96孔V型微量反应板各孔中加25μL生理盐水；——加25μL经处理的血清于第一孔中，混匀后取25μL加到第2孔中，依次倍比稀释，从第2孔加至第11孔，第11孔混匀后吸取25μL弃去，最后1孔不加血清作为对照；——每孔中加25μL4个HA单位的病毒抗原，37℃孵育40min；——每孔加25μL1%豚鼠红细胞液，37℃孵育40min。4.5结果判定将反应板倾斜70度左右，若无凝集反应，则沉淀的红细胞向下滑动，呈流线状，记录为抗体阳性。完全抑制凝集的抗体最高稀释倍数为血清的HI抗体滴度。抗体滴度大于等于16为阳性，小于等于8为阴性。若检测发病后双份血清（第一份血清应在临床症状出现后立即采集，第二份血清在两周后采集），抗体滴度上升4倍或4倍以上时，表明羊只近期被感染。DB32/T3686—20193附录A（资料性附录）引物A.1引物序列表A.1用于RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测的引物、探针引物靶基因序列（5’-3’）产物MFM基因AGTGATCTAGATGATGATCCA346bpMRM基因GTTATTGATCCAATTGCTGTqMFM基因GCTTGGCTTCTTTGAAATGG150bpqMRM基因GCCTGCAGAAGTTCCTTGTCCPIV3ProbeM基因FAM-CAATCGGACTAGCCAAGTATGGTGGGA-TAMRAA.2引物的溶解引物MF、MR、qMF、qMR用灭菌的DEPC处理水溶解到浓度为10µmol/L；CPIV3Probe用灭菌的DEPC处理水溶解到浓度为10µmol/L。DB32/T3686—20194附录B（资料性附录）1%豚鼠红细胞的配制B.1生理盐水配制方法氯化钠（NaCl）0.9g去离子水加至100mL，121℃高压灭菌15min，冷却后保存于2℃～8℃冰箱中备用。B.21%豚鼠细胞悬液制备无菌采集豚鼠血液，置于EDTA抗凝管中混匀，2℃～8℃保存。使用前吸取红细胞悬液置离心管中，加入生理盐水洗涤3次，每次以2000r/min离心5min，将血浆、白细胞等充分洗去，沉积的红细胞用生理盐水稀释成1%的悬液，保存于2℃～8℃冰箱中备用。───────────