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ICS65.120B46DB34安徽省地方标准DB34/T1358—2011饲料中黄霉素的测定－高效液相色谱法Determinationofflavomycininfeed－Highefficiencyliquidchromatographymethod文稿版次选择2011-03-16发布2011-04-16实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T1358—2011I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省畜牧兽医局提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽省兽药饲料监察所(安徽省畜产品质量安全检测中心)。本标准主要起草人：明文庆、刘红云、张莉、蔡一杰、吴蕾、丁作坤、陶小平、钱志平、吴昊。DB34/T1358—20111饲料中黄霉素的测定－高效液相色谱法1范围本标准规定了饲料中黄霉素检验的高效液相色谱法测定方法。本标准适用于饲料中黄霉素的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样3试样制备按GB/T14699.1抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩减取约200g，粉碎至过0.45mm孔径的分析筛，混匀，装入磨口瓶中备用。4原理饲料中黄霉素经50％的甲醇提取后，用pH6.0磷酸盐缓冲液稀释至所需浓度，反相色谱柱进行分离，紫外检测器检测，外标法定量。5试剂和溶液5.1除非另有说明，本法所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682二级水的规定。5.2黄霉素对照品：纯度100％。5.3黄霉素储备液：精密称取黄霉素对照品适量，用甲醇配制成1mg/mL，作为标准储备溶（贮存4℃冰箱保存10天）。5.4黄霉素标准工作液：量取适量黄霉素储备液，用pH6.0磷酸盐缓冲液稀释成浓度为0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.50µg/mL的系列标准工作液（4℃保存7天）。5.5甲醇：色谱纯。5.6乙腈：色谱纯。5.7甲酸铵。5.8磷酸。5.9pH6.0磷酸盐缓冲液：称取磷酸氢二钾2g与磷酸二氢钾8g，加水使溶解成1000mL，即得。6仪器设备DB34/T1358—201126.1高效液相色谱仪(配紫外检测器)。6.2饲料粉碎机。6.3分析天平，感量0.0001g，0.001g。7测定步骤7.1试样提取称取粉碎后的饲料样品5g（精确至0.001g），加入50.0mL50％甲醇溶液提取后，过滤，滤液用磷酸盐缓冲液pH6.0稀释至所需的适当浓度，经0.45μm滤膜过滤后供高效液相色谱仪分析。7.2色谱条件色谱柱：C18柱(4.6×150mm，5μm)或性能相当的色谱柱。流速：0.7mL/min。检测波长：258nm。进样量：20μL。流动相：乙腈:0.2％甲酸铵水溶液=45:55（用10％磷酸调节至pH4.9）7.3上机测定取标准工作液和样品试液分别注入液相色谱仪，记录谱图，按外标法以峰面积进行计算。8结果计算按照下式计算试样中药物的含量：n1000mAs1000VCsAX××××××=................................(1)式中：X——试样中药物的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；A——应的色谱峰面积响应值；As——标准溶液对应的色谱峰面积响应值；V——定容体积，单位为毫升（mL）；Cs——标准溶液的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；m——试样质量，单位为克（g）；n——稀释倍数。平行测定结果用算术平均值表示，结果保留3位有效数字。9检测方法灵敏度、准确度、精密度9.1灵敏度本方法的检测限为0.5mg/kg。9.2准确度本方法添加浓度1.0mg/kg，回收率为80％～120％。DB34/T1358—201139.3精密度本方法的批内变异系数CV≤10％，批间变异系数CV≤15％。DB34/T1358—20114AA附录A（资料性附录）黄霉素标准溶液色谱图图A.1黄霉素标准溶液色谱图_________________________________