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ICS65.120B46DB34安徽省地方标准DB34/T1363—2011饲料中喹烯酮的测定-高效液相色谱法DeterminationofQuinocetoneinfeedHighperformanceliquidchromatography文稿版次选择2011-03-16发布2011-04-16实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T1363—2011I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省畜牧兽医局提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽省兽药饲料监察所(安徽省畜产品质量安全检测中心)。本标准主要起草人：刘发全、丁在亮、许世富、刘红云、明文庆、张莉、蔡东东。DB34/T1363—20111饲料中喹烯酮的测定-高效液相色谱法1范围本标准规定了饲料中喹烯酮检验的制样和高效液相色谱（HPLC）测定方法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料中喹烯酮的定量检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样3试样制备按GB/T14699.1采样，选取有代表性的饲料样品至少500ｇ，四分法缩减至100ｇ，磨碎，全部通过0.42mm分析筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。4原理试样中的喹烯酮先用甲醇溶液提取，固相萃取小柱净化，用高效液相色谱仪测定，以外标法进行定量分析。5试剂和材料5.1除特殊说明外，本标准所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的二级水。5.2喹烯酮标准品：纯度98.0％。5.3乙腈，色谱纯。5.4甲醇，色谱纯。5.5磷酸。5.6提取液：甲醇:水=80:20。5.7淋洗液1：0.02mol/L盐酸：移取1.67mL盐酸用水定容至1000mL。5.8淋洗液2：0.1mol/L盐酸：移取8.33mL盐酸用水定容至1000mL。5.9洗脱液：甲醇:水=40:60。5.10固相萃取柱：中性氧化铝，150mg/6mL。5.11喹烯酮标准贮备液：500μg/mL。准确称取100mg喹烯酮标准品(精确至0.00002g)于200mL棕色容量瓶中，用洗脱液（5.8）常温超声溶解，定容至刻度并摇匀，配制成标准贮备液，贮于4℃冰箱中，有效期90天。DB34/T1363—201125.12喹烯酮标准工作溶液：分别吸取（5.10）中标准贮备液0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0mL于100mL棕色容量瓶中，用洗脱液（5.8）溶液定容，配制成0、2.50、5.00、10.0、20.0、50.0、100μg/mL标准工作溶液。5.13流动相：乙腈：甲醇：水=25:20:55，每1000ml混合液中加2mL磷酸。5.14滤膜：0.45μm有机滤膜。6仪器和设备6.1高效液相色谱仪，配置二极管阵列检测器或紫外检测器。6.2分析天平：感量0.0002g。6.3真空泵(0.1Mpa)。6.4恒温水浴锅。6.5旋转蒸发仪。6.6离心机：5000r/min。6.7超声波清洗机。6.8饲料粉碎机7测定步骤7.1条件测定过程应在避光操作及使用棕色容器。7.2提取准确称取适量试样(配合饲料5g，浓缩饲料2g，复合预混合饲料1g，精确至0.0002g于离心管中，加入甲醇﹕水溶液（5.8）50mL，超声提取30分钟后，4000r/min离心10min，上清液过滤备用。7.3净化分别用3mL甲醇和水对SPE（5.9）小柱进行活化，取提取液（7.2）3ml过小柱，控制过柱速度不超过1.0mL/min，分用3mL淋洗液1（5.6）、淋洗液2（5.7）淋洗小柱，吹干，用3ml甲醇：水溶液（5.8）洗脱，收集洗脱液过0.45μm滤膜(5.13)，上机测定。7.4色谱条件色谱柱：C18(4.6×250mm，5μm)，或者相当色谱柱；检测波长：260nm；流速：1.0mL/min；进样体积：10μL。7.5上机测定取标准工作液和样品试液分别注入液相色谱仪，记录谱图，按外标法以峰面积进行计算。8结果计算与表述DB34/T1363—20113按照下式计算试样中喹烯酮的含量：1000mAs1000VCsAX×××××=..................................(1)式中：X——试样中喹烯酮的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；A——试样溶液对应的色谱峰面积响应值；As——标准溶液对应的色谱峰面积响应值；V——定容体积，单位为毫升（mL）；Cs——标准溶液的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；m——试样质量，单位为克（g）。平行测定结果用算术平均值表示，结果保留三位有效数字。9检测方法灵敏度、准确度、精密度9.1灵敏度本方法饲料中喹烯酮检测限为2mg/kg。9.2准确度本方法在添加浓度为4mg/kg的回收率为80％～120％。9.3精密度本方法的批内变异系数CV≤10％，批间变异系数CV≤15％。DB34/T1363—20114AA附录A（资料性附录）喹烯酮标准品高效液相色谱图图A.1喹烯酮标准品高效液相色谱图_________________________________