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ICS65.120B46DB34安徽省地方标准DB34/T1368—2011饲料中己烯雌酚的测定-气相色谱质谱法Determinationofdiethylstilbestrolinfeed-Gaschromatographymassspectrometrymethod2011-03-16发布2011-04-16实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T1368—2011I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省畜牧兽医局提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽省兽药饲料监察所(安徽省畜产品质量安全检测中心)。本标准主要起草人：刘红云、吴蕾、蔡一杰、张莉、明文庆、丁作坤、陶小平、钱志平、吴昊。DB34/T1368—20111饲料中己烯雌酚的测定-气相色谱质谱法1范围本标准规定了饲料中己烯雌酚检验的气相色谱质谱测定方法。本标准适用于饲料中己烯雌酚的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样3试样制备按GB/T14699.1抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩减取约200g，粉碎至过0.45mm孔径的分析筛，混匀，装入磨口瓶中备用。4原理饲料中己烯雌酚经缓冲液均质后，用乙腈提取，经净化、洗脱、浓缩、用N,O-双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）+三甲基氯硅烷（TMCS）衍生化后，气相色谱质谱进行定性、定量分析。5试剂和溶液5.1除非另有说明，本法所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682二级水的规定。5.2己烯雌酚对照品：纯度≥99％。5.3己烯雌酚储备液：准确称取己烯雌酚对照品适量，用甲醇溶解成1.0mg/mL标准储备溶液。4℃冰箱保存，有效期6个月。5.4己烯雌酚标准工作液：将储备液用甲醇稀释成10、50、100、200、500、1000µg／L的标准工作液，在4℃冰箱中存放备用，有效期7天。5.5正己烷。5.6乙酸乙酯。5.7碳酸钠。5.8正丙醇。5.9甲苯：色谱纯。5.10甲醇:色谱纯。5.11乙腈:色谱纯。DB34/T1368—201125.12正己烷/乙酸乙酯：A溶液为85:15（V/V）和B溶液为70:30(V/V)。5.1310％碳酸钠溶液。5.140.02mol/L乙酸铵溶液：称取1.54g乙酸铵，加水溶解并稀释至800mL左右，调节pH值至5.2，定容至1000mL。5.15衍生化试剂：N,O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）+三甲基氯硅烷TMCS（99:1）5.16硅胶固相萃取柱:规格1000mg/6mL。5.17微孔滤膜：孔径0.25µm，有机相。6仪器设备6.1气相色谱质谱仪。6.2高速冷冻离心机，不低于4000r/min。6.3饲料粉粹机6.4pH计。6.5氮吹仪。6.6旋转蒸发仪。6.7固相萃取装置。6.8分析天平，感量0.0001g，0.001g。6.9振荡器。6.10涡旋混合器。6.11超声波清洗机。6.12离心管，50mL。6.13干燥箱。6.14梨形瓶，50mL。6.15单通道可调移液器：1～10µL、5～50µL、50～200µL、200-1000µL。7测定步骤7.1试样提取称取粉碎后的饲料样品5g左右（精确至0.001g）于50mL离心管中，加入10mL乙酸铵溶液，均质1min，加入10mL乙腈，涡旋振荡提取30s，以4000r/min离心2min，收集乙腈提取液，残渣再以10mL乙腈，步骤同前，合并两次提取液。7.2净化上述提取液中加入8mL正己烷和2mL乙酸乙酯，涡漩混合1min后以4000r/min离心5min，吸取中间层于50mL梨形瓶中，加入5mL正丙醇，在50℃水浴中旋转浓缩至干。用10mL乙酸乙酯溶解残渣，移入离心管中，加入2mL10％碳酸钠溶液，漩涡混合1min，以4000r/min离心5min，弃去下层水相，再加入2mL10％碳酸钠溶液，重复上述步骤后将乙酸乙酯移入10mL试管中，在50℃水浴中用氮气吹干。用2mLA溶液（5.11）溶解残渣，转移到用5mL正己烷、5mL乙酸乙酯活化并抽干处理后的硅胶柱上，用5mL正己烷淋洗，弃去正己烷淋洗液，抽干柱子，用5mLB溶液（5.11）洗脱，收集洗脱液，在50℃水浴中用氮气吹干。DB34/T1368—201137.3样品衍生化在7.2吹干后的样品中加入100µL衍生化试剂，振荡混合后，封口，在60℃衍生15min，50℃水浴中用氮气吹干。冷却后加入100µL甲苯，混合后进行气相色谱质谱分析。同时分别取标准工作液（5.3）系列1mL用氮气吹干，加入100µL衍生化试剂后按试样同法操作，进行气相色谱质谱分析。7.4气相条件色谱柱：5％苯基甲基聚硅氧烷，柱长30m，内径0.25mm，膜厚0.25μm或性能相当的色谱柱。进样口温度：220℃。升温程序：起始柱温160℃（保持1min），以15℃/min的速率升温至290℃保持（5min）。载气：氦气纯度99.999％。流量：1.0mL／min。进样方式：不分流进样。进样体积：1.0μL。7.5质谱条件样品离子源：EI源。离子源温度：200℃。传输线温度：280℃。四极杆温度：160℃。选择离子收集模式，收集质荷比（m/z）为383，397，412，413m/z的4个碎片离子。7.6上机测定取标准工作液和样品试液分别注入气质联用仪，记录谱图，按外标法以峰面积进行计算。8定性定量方法定性方法：样品与标准品保留时间的相对标准偏差不大于0.5％。特征离子基峰丰度与标准品相差不大于20％。定量方法：以383，397，412，413峰面积之和进行校正定量。9结果计算按照下式计算试样中药物的含量：ACsVXAsm××=×.....................................(1)式中：X——试样中药物的含量，单位为微克每千克（µg/kg）；A——试样溶液的选择性离子色谱图中的峰面积响应值；As——标准溶液的选择性离子色谱图中的峰面积响应值；V——定容体积，单位为毫升（mL）；DB34/T1368—20114Cs——标准溶液的浓度，单位为微克每升（μg/L）；m——试样质量，单位为克（g）。计算结果扣除空白值，平行测定结果用算术平均值表示，结果保留3位有效数字。10检测方法灵敏度、准确度、精密度10.1灵敏度本方法的检测限为1.0µg/kg。10.2准确度本方法添加浓度为2.0µg/kg，回收率为80％～120％。10.3精密度本方法的批内变异系数CV≤10％，批间变异系数CV≤15％。DB34/T1368—20115AA附录A（资料性附录）己烯雌酚标准品衍生物的选择离子质谱图图A.1己烯雌酚标准品衍生物的选择离子质谱图_________________________________