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ICS07.100.30C53DB34安徽省地方标准DB34/T1374—2011生鲜乳中三聚氰胺的测定—酶联免疫吸附法DeterminationofMelamineinRawMilkEnzymeLinkedimmunosorbentassay2011-03-16发布2011-04-16实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T1374—2011I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省畜牧兽医局提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽省兽药饲料监察所(安徽省畜产品质量安全检测中心)。本标准主要起草人：许世富、丁作坤、汤春莲、陶小平、吴昊、陈文帮、李珲。DB34/T1374—20111生鲜乳中三聚氰胺的测定—酶联免疫吸附法1范围本标准规定了生鲜乳中三聚氰胺检测的酶联免疫吸附测定方法。本标准适用于生鲜乳中三聚氰胺的常规快速测定，阳性样品需用气相色谱－质谱法（GC/MS）或液相色谱质谱法（LC/MS-MS）确证。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3试样制备采集的生鲜乳应密闭保存于-18℃的冰柜中，用前恢复至室温，摇匀，备用。4原理本方法是酶联免疫法中的竞争性测定法，其主要原理是：样品中游离的三聚氰胺与酶标板上固定的三聚氰胺抗原竞争特异性抗体，通过酶标Ⅱ抗的反应，洗掉游离的酶标物，再通过酶的专一性显色剂显色，根据显色的深浅来判断样品中三聚氰胺的含量。根据竞争性原理，样品中游离的三聚氰胺少，则酶标Ⅱ抗结合多，显色就深，相反，则显色浅。结果可以通过在450nm处测定吸收值计算，颜色变化的程度反映样品中三聚氰胺的含量，在一定浓度范围内吸光度的高低与样品中三聚氰胺的含量成反比。5试剂和材料5.1除非另有说明，本法所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的二级水。5.2竞争酶标免疫法三聚氰胺试剂盒，2℃～8℃冰箱中保存。5.2.1微孔板：包被有三聚氰胺抗原。5.2.2三聚氰胺标准溶液：0ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、90ng/mL、270ng/mL、810ng/mL。5.2.3三聚氰胺酶标Ⅱ抗工作液。5.2.4三聚氰胺抗体工作液。5.2.5浓缩样本稀释液。5.2.6浓缩洗涤液。5.2.7底物A液。5.2.8底物B液。5.2.9终止液。DB34/T1374—201125.3洗涤液：用水20倍稀释厂商提供的浓缩洗涤液。5.4样本稀释液：用水4倍稀释厂商提供的浓缩样本稀释液。6仪器和设备6.1酶标仪（配备450nm滤光片）。6.2分析天平：感量0.00001g，感量0.001g。6.3振荡器。6.4恒温干燥箱。6.5微量加样器及配套吸头：单道20μL，50μL，100μL，1000μL，多道50μL～300μL。7测定步骤7.1样品处理取生鲜乳样品100μL，加入900μL样本稀释液，充分混匀，取50μL用于检测。7.2测试程序7.2.1测定在室温20℃～25℃条件下操作，测定之前将试剂盒以及所有试剂在室温（20℃～25℃）下放置1h～2h。7.2.2将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架，标准和样品做两个平行实验，记录下标准和样品的位置。7.2.3分别在各孔中加50µL的标准品溶液或样品溶液。7.2.4分别在各孔中加50µL的抗体工作液。7.2.5盖好盖板膜，轻轻晃动反应板数秒，(25±2)℃反应30min。7.2.6倾出微孔中的液体，加250µL洗涤工作液，轻轻振荡30s，倾出微孔中的洗涤液，在吸水纸上拍打，彻底清除微孔中的残留液和气泡，重复上述操作3遍。7.2.7立即在每孔中加入100µL酶标Ⅱ抗工作液。7.2.8盖好盖板膜，轻轻晃动反应板数秒，(25±2)℃反应30min。7.2.9倾出微孔中的液体，加250µL洗涤工作液，轻轻振荡30s，倾出微孔中的洗涤液，在吸水纸上拍打，彻底清除微孔中的残留液和气泡，重复上述操作3遍。7.2.10立即在每孔中加入100µLAB混合液（用前5min内按体积比1:1配制），轻轻晃动反应板数秒，(25±2)℃避光反应(10～15)min。7.2.11每孔加50µL终止液（推荐使用多通道加样器），轻轻振荡混匀，10min内在450nm下检测吸光度。8结果判定和表述按下式计算百分吸光度值：百分吸光度值（％）=0BB×100％............................(1)式中：B——为标准溶液或供试样品的平均吸光度值；DB34/T1374—20113Bo——为零标准的标准溶液平均吸光度值。用专业计算机软件求出供试样品中三聚氰胺的浓度，乘以稀释系数即得检测结果。或计算出的标准相对吸光度值绘成为一个对应浓度（ng/mL）的半对数坐标系统曲线图，校正曲线在10ng/mL～810ng/mL范围内应当成为线性。相对应每一个样品的浓度（ng/mL）可以从校正曲线上读出。9检测方法灵敏度、准确度、精密度9.1灵敏度本方法在生鲜乳中的检测限为100ng/mL。9.2准确度本方法在200ng/mL添加浓度水平上的回收率为70％～120％。9.3精密度本方法的批内变异系数CV％≤10％，批间变异系数CV％≤15％。_________________________________