DB34T 1997-2013 食用油中氧化甘油三酯（OX-TG）及其聚合物（TGP）的测定 高效空

ICS67.200.10X14DB34安徽省地方标准DB34/T1997—2013食用油中氧化甘油三酯（OX-TG）及其聚合物（TGP）的测定高效空间排阻色谱法Determinationofoxidizedtriacylglycerol(OX-TG)andoxidizedtriacyldycerolpolymer(TGP)inedibleoilsbyahigh-performancesize-exclusionchromatography2013-12-05发布2014-01-05实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T1997—2013I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省质量技术监督局、安徽省食品质量安全检验方法标准化技术委员会提出。本标准由安徽省食品质量安全检验方法标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽国家农业标准化与监测中心、国家农副加工食品质量监督检验中心、上海市粮食科学研究所。本标准主要起草人：徐彦辉、何俊、房志杰、曹文明、顾亮、聂磊、薛斌、姚彦如。DB34/T1997—20131食用油中氧化甘油三酯（OX-TG）及其聚合物（TGP）的测定高效空间排阻色谱法1范围本标准规定了食用油中氧化甘油三酯（OX-TG）及其聚合物（TGP）的测定高效空间排阻色谱法。本标准适用于食用油中氧化甘油三酯（OX-TG）及其聚合物（TGP）的测定。本标准的方法检出限为0.2％。本标准适用于风险监控及科学研究。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，neqISO3696：1997）GB/T6379.1测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第1部分:总则与定义(GB/T6379.1-2004，ISO5725-1：1994，IDT)GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第2部分:确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GB/T6379.2-2004，ISO5725-2：1994，IDT)3原理通过自动制备型快速柱层析技术的分离，油脂试样被分为非极性组分和极性组分两部分，其中极性组分用高效空间排阻色谱进行分析，采用面积归一化法进行定量。4试剂4.1除非另有说明，仅使用分析纯试剂，水为GB/T6682规定的一级水。4.2乙醚，使用前使其回温至10℃～18℃之间。4.3石油醚，30℃～60℃沸程，使用前使其回温至10℃～18℃之间。4.4三氯甲烷。4.5冰醋酸。4.695％乙醇。4.7磷钼酸。4.8无水硫酸钠。4.9硅胶吸附剂：硅胶60，平均粒径为0.063mm～0.200mm（相当于ASTM规范的70目～230目的粒径分布）的无定形硅胶，孔径60Å，水分含量7±0.5％，孔体积0.8mL/g，表面积500m2/g，pH值7.0,拆封后于玻璃干燥器（5.5）内保存。DB34/T1997—201324.10非极性洗脱剂：石油醚（30℃～60℃沸程）+乙醚=87+13，870mL的石油醚（30℃～60℃沸程）（4.2）中加入130mL的乙醚（4.1），充分混匀，现用现配。4.11极性组分洗脱液：丙酮+乙醚=40+60，600mL的乙醚（4.1）中加入400mL的丙酮（4.15），充分混匀，现用现配。4.12薄层色谱展开剂：石油醚（30℃～60℃沸程）+乙醚+冰醋酸=70+30+2，70mL的石油醚（30℃～60℃沸程）（4.2）中加入30mL的乙醚（4.1）和2mL的冰醋酸（4.4），充分混匀，现用现配。4.13薄层色谱显色剂：100克的磷钼酸（4.6）固体先完全溶解于适量的95％乙醇（4.5）中，然后再用95％乙醇稀释至1L，最后分装入喷雾瓶中。4.14薄层色谱层析板：长200mm、宽100mm的玻璃板，上涂一层0.25mm厚的硅胶60（平均粒径为10～12µm，其它性质参数同“4.8”）或其它等效硅胶，且不含任何的荧光指示剂。4.15薄层色谱点样毛细管：长100mm，内径0.3mm。4.16丙酮,使用前使其回温度至10℃～18℃之间。。4.17食用油极性组分FLASH色谱柱（EOPCFLASH）：内填装20g粒径为40μm～60μm的硅胶，柱外壳为聚丙烯制成，铝箔密封包装。4.1810mL一次性使用无菌注射器。5仪器与设备5.1旋转蒸发仪。5.2分析天平：感量为0.1mg。5.3真空恒温干燥箱。5.4恒温干燥箱。5.5玻璃干燥器（内装有变色硅胶干燥剂）。5.6薄层色谱玻璃层析缸，能与薄层色谱板（4.13）配套。5.7食用油极性组分快速制备型柱层析系统（EOPCPFCSYSTEM）：配置二元泵、紫外检测器、自动收集系统、实时监测系统和溶剂温度控制系统。5.8标准磨口500mL圆底烧瓶。5.910mL玻璃烧杯。5.101000mL小口玻璃收集瓶。6分析步骤6.1试样的制备6.1.1除杂质作为试样的样品应为液态、澄清、无沉淀并充分混匀。如果样品不澄清、有沉淀，则须将油脂置于50℃的水浴或恒温干燥箱（5.4）内，将油脂的温度加热至50℃并充分振摇以熔化可能的油脂结晶。若此时油脂样品变为澄清、无沉淀，则可作为试样，否则应将油脂置于50℃的恒温干燥箱（5.4）内，用滤纸过滤不溶性的杂质，取过滤后的澄清液体油脂作为试样，为防止油脂氧化，过滤过程应尽快完成。对于凝固点高于50℃或含有凝固点高于50℃油脂成分的样品，则须将油脂置于比其凝固点高10℃左右的水浴或恒温干燥箱（5.4）内，将油脂加热并充分振摇以熔化可能的油脂结晶。若还需过滤，则将油脂置于比其凝固点高10℃左右的恒温干燥箱（5.4）内，用滤纸过滤不溶性的杂质，取过滤后的澄清液体油脂作为试样，为防止油脂氧化，过滤过程应尽快完成。DB34/T1997—201336.1.2干燥脱水若油脂中含有水分，则通过“5.1.1”的处理后仍旧无法达到澄清，须进行干燥脱水。对于室温下为液态、无明显结晶或凝固现象的油脂，以及经过“5.1.1”的处理并冷却至室温后为液态、无明显结晶或凝固现象的油脂，可按每10g油脂加入1～2g无水硫酸钠（4.7）的比例加入无水硫酸钠，并充分搅拌混合吸附脱水，然后用滤纸过滤，取过滤后的澄清液体油脂作为试样。对于室温下有结晶或凝固现象的油脂，以及经过“5.1.1”的处理并冷却至室温后有明显结晶或凝固现象的油脂，可将油脂样品用适量的石油醚（4.2）完全溶解后再用无水硫酸钠吸附脱水，然后滤纸过滤收集滤液，将滤液置于水浴温度为45℃的旋转蒸发仪（5.1）内，负压条件下，将其中的溶剂旋转蒸干，取残留的澄清液体油脂作为试样。6.2FLASH色谱柱的活化以非极性组分洗脱液（4.9）为流动相对EOPCPFCSYSTEM层析系统（5.7）的流动相管路进行润洗，排尽流动相管路内的气体。取1支EOPCFLASH色谱柱（4.16），连接入EOPC快速制备型柱层析系统的流动相管路，以非极性组分洗脱液（4.9）为流动相，25mL/min的流速冲洗FLASH色谱柱10min，使FLASH色谱柱完全被溶剂所浸润。6.3非极性组分的分离取1只干净的10mL玻璃烧杯（5.9），准确称取1g（精确到0.001g）的油脂样品（m），然后用5mL的石油醚（30℃～60℃沸程）（4.2）将油脂样品充分溶解，成为上样液。将FLASH色谱柱的上端与流动相管路断开，用1支干净的10mL一次性塑料注射器（4.17）吸取全部的上样液后，快速注射入FLASH色谱柱的上端入口处，再用3mL的石油醚（30℃～60℃沸程）洗涤10mL玻璃烧杯内残留的上样液，洗涤液也用同一支10mL一次性塑料注射器全部吸取后，注射入FLASH色谱柱的上端入口处，再将FLASH色谱柱的上端与流动相管路连接，按以下参数进行非极性组分的分离：a)流动相：非极性组分洗脱液（4.9）；b)流动相流速：25mL/min；c)部分收集器：以1000mL小口玻璃收集瓶（5.10）为收集容器，从洗脱开始以全收集模式进行收集；d)紫外检测器监测波长：200nm；e)启用实时监测系统，获得洗脱色谱图；f)溶剂温度控制系统温度：10℃；g)洗脱时间：11min。注：进行分离操作时，实验的环境温度应控制在10℃～25℃间。6.4极性组分的洗脱取1个干净的500mL圆底烧瓶（5.8）放入（103±2）℃的恒温干燥箱（5.4）内，烘1h左右，然后取出立即放入玻璃干燥器（5.5）内冷却至室温，然后称重（M1）。在完成“6.3”的操作后，立即对吸附有极性组分的FLASH色谱柱进行进一步的洗脱处理，具体参数如下：a)流动相：极性组分洗脱液（4.10）；b)流动相流速：25mL/min；c)部分收集器：以另一个干净的1000mL小口玻璃收集瓶（5.10）为收集容器，从洗脱开始以全收集模式进行收集；d)紫外检测器监测波长：200nm；DB34/T1997—20134e)启用实时监测系统，获得洗脱色谱图；f)溶剂温度控制系统温度：10℃；g)洗脱时间：20min。将1000mL小口玻璃收集瓶内所有收集的洗脱液倒入500mL圆底烧瓶中，然后将此装有收集洗脱液的500mL圆底烧瓶置于水浴温度为60℃的旋转蒸发仪（5.1）内，先在非真空条件下，将其中的溶剂旋转蒸发至一半，再在负压条件下，将其中的溶剂旋转蒸发至近干。然后将此500mL圆底烧瓶放入40℃的真空恒温干燥箱（5.3），在0.1MPa的负压条件下，烘20min～30min后放入玻璃干燥器（5.5）内冷却至室温，其中的残留物即为极性组分。然后称重（M2）,（M2-M1）即为极性组分的质量。用100mL的四氢呋喃溶解极性组分，待上机分离检测。获得的非极性组分和极性组分的分离效果须按照附录C进行验证。注1：若洗脱液的量太大，可分多次收集并浓缩，即先收集部分洗脱液于500mL的圆底烧瓶中，旋转蒸干这部分溶剂后，再用同一个500mL的圆底烧瓶继续收集剩余的洗脱液，并旋转蒸干。注2：一般情况下，油脂的极性组分中含有甘油三酯氧化裂解产生的小分子挥发性物质，很难避免这类物质在真空干燥过程中的损失，致使本标准测得的极性组分含量会比真实的极性组分含量略低。6.5平行试验按试样处理步骤，对同一样品进行平行试验测定。6.6测定6.6.1空间排阻色谱分析条件a)色谱柱：Styragel凝胶色谱保护柱+StyragelHR1TH(φ7.8mm×300mm)+StyragelHR0.5TH(φ7.8mm×300mm)或柱效相当的串联空间排阻色谱柱；b)柱温：35℃；c)进样量：10μL；d)流速：0.7mL/min；e)流动相：四氢呋喃；f)检测器：示差折光检测器（检测池温度35℃）。6.6.2定性测定依据聚苯乙烯标准相对分子质量进行定性，油样极性组分典型的色谱分离图见附录B。各组分依分子量大小顺序出峰，对应的色谱峰依次为氧化甘油三酯寡聚物(TGO)、氧化甘油三酯二聚物(TGD)、氧化甘油三酯单体(OX-TG)、甘油二酯(DG)、游离脂肪酸(FFA)等。6.6.3定量测定假设所有洗脱出的样品组分具有相同的响应系数，采用峰面积归一化法进行定量测定。6.7结果计算氧化甘油三酯按式（1）计算：%100)(1MMSSSSSSXpOTHDGTGOXTGDTGOTGOX.................(1)DB34/T1997—20135氧化甘油三酯聚合物含量按式（2）计算：%100)()(2MMSSSSSSSXpOTHDGTGOXTGDTGOTGDTGO.................(2)式中：X1——油样中氧化甘油三酯的含量，％；X2——油样中氧化甘油三酯聚合物的含量，％；STGO——氧化甘油三酯寡聚物(TGO)的峰面积；STGD——氧化甘油三酯二聚物(TGD)的峰面积；SOX-TG——氧化甘油三酯单体(OX-TG)的峰面积；SDG——甘油二酯单体(DG)的峰面积；SOTH