DB34T 2241-2014 畜禽饲料中伏马菌素B1的测定酶联免疫吸附法

ICS65.120B46DB34安徽省地方标准DB34/T2241—2014畜禽饲料中伏马菌素B1的测定—酶联免疫吸附法DeterminationoffumonisinB1inanimalfoodstuff—Enzymelinkedimmunosorbentassay文稿版次选择2014-12-17发布2015-01-17实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T2241—2014I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准有安徽农业大学提出。本标准起草单位：安徽农业大学、和县畜牧兽医局、马鞍山市农业委员会。本标准起草人：王希春、伋兆法、吴金节、夏效平、陈祥国、李复辉、樊海新、李玉、冯士彬、李贺侠、张宁。DB34/T2241—20141畜禽饲料中伏马菌素B1的测定-酶联免疫吸附法1范围本标准规定了畜禽饲料中伏马菌素B1的酶联免疫吸附法测定的术语和定义、原理、设备、试剂、检测步骤。本方法适用于饲料原料或配合饲料中伏马菌素B1的测定。本方法的最低检测限为10µg/kg。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1伏马菌素B1fumonisinB1，FB1伏马菌素B1是主要由串珠镰刀菌代谢产生的一种真菌毒素。4原理待检样品中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合，如待检样品中无抗原，则酶标抗原能顺利的与固相抗体结合。如待检样品中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合。待检样品中抗原含量愈多，结合在固相抗体上的酶标抗原愈少，则其最后加入酶底物后显色也愈浅。颜色的深浅与待检样品中抗原含量成反线性相关。5设备5.1粉碎机（DYF-500）5.2分析天平（精确到0.001g）5.3涡旋混匀器（SZ-1）5.4酶标仪（MK3，波长450nm）5.5酶标板（48孔或96孔）5.6单道微量移液器（10µL、100µL、1000µL）DB34/T2241—201425.7多道微量移液器（300µL）6试剂6.1本检测方法所用试剂，凡未指明规格者，均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。6.2乙腈-水：1:1（V:V）6.3包被抗原FB16.4FB1单克隆抗体6.5HRP-羊抗小鼠IgG6.6包被缓冲液：碳酸钠（Na2CO3）1.59g，碳酸氢钠（NaHCO3）2.93g，加水溶解，调pH至9.6，定容至1000mL。6.7洗涤液PBST：磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2g，磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O）2.9g，氯化钠（NaCl）8g，氯化钾（KCl）0.2g，吐温-200.5mL，加水溶解，调pH至7.4，定容至1000mL。6.8封闭液：5％脱脂奶粉，称取5g脱脂奶粉，加入洗涤液至100mL，保存于4℃冰箱中。6.9FB1标准贮备溶液：称取1mgFB1标准品，用乙腈水配制成约1mg/mLFB1贮备液。贮备液置于4℃冰箱中避光保存。6.10FB1标准溶液：精确吸取标定后的标准储备液，用乙腈水新鲜配制成FB1标准溶液，浓度分别为2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL。6.11TMB底物显色液——A液：醋酸钠（C2H3O2Na）13.6g，柠檬酸（C6H8O7•H2O）1.6g，30％双氧水（H2O2）0.3mL，加水至500mL。——B液：乙二胺四乙酸二钠（EDTA）0.2g，柠檬酸（C6H8O7•H2O）0.95g，甘油（C3H8O3）50mL，TMB0.15g，加水至500mL。使用前，A液和B液按1:1混合使用。6.12终止液：2mol/LH2SO4溶液。7检测步骤7.1样品饲料原料或配合饲料。7.2试样制备按GB/T14699.1饲料采样方法取得试样800g，四分法缩减至100g，磨碎，并通过0.90mm孔径分子筛。7.3毒素提取7.3.1称取20g粉碎并通过0.90mm孔径的分子筛的试样，置于250mL具塞锥形瓶中，加入100mL乙腈水溶液，振荡30min，静置后取上清，滤纸过滤。7.3.2分装滤液，-20℃保存待测。7.4检测7.4.1将抗原用包被液稀释至需要浓度，在96孔酶标板上加入100µL，4℃过夜。DB34/T2241—201437.4.2酶标板用PBST洗涤3次，每次3min，拍干。7.4.3加入100µL封闭液，37℃1h。7.4.4PBST洗涤3次，每次3min，拍干。7.4.5每孔分别加入不同浓度FB1标准品溶液、样品提取液50µL，抗体液50µL，空白对照孔加入100µL抗体液，37℃，1h。7.4.6PBST洗涤3次，每次3min，拍干7.4.7加入100µL酶标二抗，37℃，1h。7.4.8PBST洗涤3次，每次3min，拍干。7.4.9加入100µLA液B液混合后底物溶液，37℃，1h。7.4.10加入50µL终止液，终止反应。7.4.11用酶标仪在450nm处测定吸光度值。7.5结果处理7.5.1绘制标准曲线以不同浓度FB1标准品浓度的对数为横坐标，以B/B0百分比为纵坐标（B为各竞争标准品浓度测得的OD450值，B0为不含标准品时测得的OD450值）绘制标准曲线。7.5.2计算结果所得实验数据按公式（1）计算：McVXW......................................(1)式中：W——伏马菌素B1的浓度，ng/g；c——酶标板上测得的FB1的浓度（根据标准曲线求得），ng/mL；V——样品提取液的体积，mL；X——样品提取液稀释倍数；M——样品质量，g；计算结果表示到小数点后一位有效数字。7.6重复性在相同条件下获得的两次独立测定结果的相对误差不大于10％。7.7回收率本方法的回收率为83％～96％。DB34/T2241—20144AA附录A（资料性附录）伏马菌素B1标准品的标准曲线伏马菌素B1标准品的标准曲线见图A.1。y=-34.715x+87.277R2=0.9961010203040506070809000.511.522.53对数(标准品浓度，ng/mL)B/B0%系列1线性(系列1)图A.1伏马菌素B1标准品的标准曲线图_________________________________