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ICS67.120.30B50DB34安徽省地方标准DB34/T2252—2014水产品中孔雀石绿残留的检测—胶体金免疫层析法Detectionofmalachitegreenresidueinaquaticproducts-Colloidalgoldimmunochromatographicmethod文稿版次选择2014-12-17发布2015-01-17实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T2252—2014I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由合肥市渔政监督管理站提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：合肥市畜牧水产技术推广中心、合肥市渔业协会、杭州南开日新生物技术有限公司。本标准起草人：赖年悦、孙德祥、桑丽雅、周作友、徐薇、陈友顺、杨锐、曹海、张军、夏俊华、陈元生、程定文、方凯、钱继银、桂淦、胡积清、戴靖、陈晓荣、徐丽、沈亭海、徐经云、洪家春。DB34/T2252—20141水产品中孔雀石绿残留的检测-胶体金免疫层析法1范围本标准规定了水产品中孔雀石绿（MalachiteGreen，MG）及其代谢物隐色孔雀石绿（LeucomalachiteGreen，LMG）残留的检测——胶体金免疫层析法的原理、试剂和材料、仪器和设备、测定步骤、结果判断及表述、结果确证的方法。本标准适用于鱼、甲鱼、龟肌肉组织和虾、蟹去壳、肠腺的可食用组织中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿残留的快速筛查检测。本标准方法的检出限为：3.0μg/kg。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理本法为竞争抑制法，将氯金酸用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒，标记抗体。样品中残留的孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿，以乙酸胺盐溶液和乙腈提取，正己烷净化，经四氯苯醌将隐色孔雀石绿氧化成孔雀石绿，转入并溶解金标微孔内包被的抗孔雀石绿抗体和胶体金的结合物，再滴加到孔雀石绿胶体金免疫快速检测试剂板的加样孔中，样品溶液以硝酸纤维素（NC）膜为载体，利用微孔膜的毛细管作用缓慢向另一端渗移，在移动的过程中，样品溶液中的孔雀石绿与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，从而抑制了抗体和检测线上特异性结合抗原的结合，未被孔雀石绿结合的抗体与检测线上的抗原反应，并通过胶体金的颜色而显示出红色条带。用胶体金读卡仪或目测比较板/卡上控制线（C线）和检测线（T线）上红色条带的有无及颜色的相对深浅进行判定。当样品中的孔雀石绿或隐色孔雀石绿含量达到或超过本方法检出限时，检测线较控制线显色淡甚至无显色，判定为阳性。反之，当样品中的孔雀石绿或隐色孔雀石绿含量在本方法检出限以下或无残留时，检测线与控制线显色一致或偏深，判定为阴性。4试剂和材料4.1除特殊注明外，本法所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的二级水。4.2对甲苯磺酸（C7H8O3S）。4.3盐酸羟胺（ClH4NO）。4.4乙酸铵（C2H7NO2）。4.5乙腈（C2H3N）。4.6中性氧化铝（Al2O3）：其悬浮液的pH为7.5，层析用，100目～200目。DB34/T2252—201424.7氯化钙（CaCl2）。4.8正己烷（C6H14）。4.9四氯苯醌（C6Cl4O2）：化学纯。4.10氢氧化钠（NaOH）。4.11乙酸胺盐溶液：称取对甲苯磺酸5.16g，盐酸羟胺0.1g，乙酸铵0.2g，加水溶解，定容至500mL，用4mol/L4.10氢氧化钠调pH至4.5。4.120.1％四氯苯醌溶液：溶解0.1g四氯苯醌（4.9）于80mL水中，加水定容至100mL。4.13孔雀石绿免疫胶体金快速检测试剂板。4.13.1孔雀石绿结合抗原：偶联率为1:10～1:20（载体蛋白:MG）。4.13.2抗孔雀石绿抗体：多抗或单抗。多抗效价应大于5000（间接ELISA法），或有效抗体含量应大于0.05mg/mL；特异性应大于5000（间接抑制ELISA法）。单抗效价应大于15000（间接ELISA法），或有效抗体含量应大于0.5mg/mL；特异性应大于5000（间接抑制ELISA法）。抗体相对亲和力应大于3.0×109（结合率下降50％时，相对应的抗体浓度的倒数）。4.13.3样品垫：玻璃纤维或纸质薄片。4.13.4金标微孔：微孔底部包被有抗孔雀石绿抗体和胶体金的结合物。4.13.5NC膜：4cm毛细管时间121s～149s。4.13.6吸水垫：滤纸、玻璃纤维或吸水纸。4.13.7背衬：PVC。4.13.8塑料模板。4.13.9PBST缓冲液。4.13.10储存与使用。密封包装，干燥阴凉处保存，用前恢复至室温，即开即用。5仪器和设备5.1电子天平：感量0.01g。5.2均质机：转速≥8000r/min。5.3离心机：离心力≥3000g。5.4氮气或空气吹干仪：加热温度≥65℃。5.5pH计：测量精度±0.02pH单位。5.6微量移液器：10μL～100μL，100μL～1000μL。5.7胶体金读卡仪：测量精度±0.02RLU（@0.4RLU）、±0.04RLU（@0.4RLU）。6测定步骤6.1试样制备鱼去鳞、去皮，取肌肉部分；甲鱼、龟取肌肉部分；虾、蟹去壳、肠腺，取可食部分。切成0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块后混合，用均质机制成糜状。6.2提取称取5.0g（±0.1g）均质后的样品于50mL离心管中，加入3mL乙酸胺盐溶液、10mL乙腈，剧烈振荡3min；加入4g中性氧化铝（4.6），剧烈振荡3min；再加入2g氯化钙，剧烈振荡1min，3000g离心5min。移取5mL上清液于另一离心管中，加入1mL正己烷，剧烈振荡，3000g离DB34/T2252—20143心1min；移取4mL下层溶液于5mL离心管中，加入0.1mL0.1％四氯苯醌溶液（4.12），摇匀，65℃氮气或空气吹干；用0.3mLPBST缓冲液（4.13.9）溶解残留物，静置2min，待测。6.3测定6.3.1取出孔雀石绿免疫胶体金快速检测试剂板（4.13），使用前恢复至室温，置于水平台面上。吸取待测样品溶液100µL于金标微孔中，轻微摇动直至孔内红色物质完全溶解，静置5min，吸取金标微孔内溶液滴加到快速检测试剂板的加样孔中，在8min～10min内目测或通过胶体金读卡仪读取结果。6.3.2空白对照：每批样品需做一孔空白对照，以PBST缓冲液（4.13.9）代替试样提取液，按6.3.1进行。6.3.3平行测定：每个样品的平行样数量≥2；分别按6.2和6.3.1进行。注：不同试剂板制造商的产品组成和操作会有细微的差别，应严格按说明书要求规范操作。7结果判断及表述7.1试剂板有效性判定7.1.1失效检测试剂板：空白对照控制线（C线）不出现红色条带（如图1），则检测试剂板失效，不能进行检测。7.1.2有效检测试剂板：空白对照控制线（C线）和检测线（T线）均出现红色条带，且T线比C线颜色深或一样深（如图2），则检测试剂板有效，可进行检测。7.2结果及表述7.2.1阴性：试样检测线（T线）出现红色条带，且颜色比控制线（C线）深或一样深（如图2），结果为阴性，孔雀石绿残留量3.0μg/kg）。7.2.2阳性：试样检测线（T线）出现红色条带，但颜色比控制线（C线）浅或检测线（T线）未出现红色条带（如图3），结果为阳性（孔雀石绿残留量≥3.0μg/kg）。8结果确证本方法检测结果为阳性的样品，需用现行有效的LC-MS/MS方法进行确证。_________________________________