DB34T 2816-2017 转基因水稻品系Bt汕优63定量检测方法 微滴式数字PCR法

ICS 67.050X04DB34安徽省地方标准DB34/T2816—2017转基因水稻品系Bt汕优63定量检测方法微滴式数字PCR法QuantitativedetectionofgeneticallymodifiedriceBt63withdropletdigitalPCRmethod文稿版次选择2017-03-30发布2017-04-30实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T2816—2017I前  言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省检验检疫科学技术研究院提出。本标准由安徽省动植物检验检疫标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：安徽省检验检疫科学技术研究院、合肥市动物卫生监督所本标准主要起草人：陈雪娇、宗凯、李云飞、孙娟娟、杨磊、郑海松、余晓峰、姚剑。DB34/T2816—20171转基因水稻品系Bt汕优63定量检测方法微滴式数字PCR法1范围本标准规定了转基因水稻Bt汕优63品系微滴式数PCR定量检测方法。本标准适用于转基因水稻Bt汕优63品系微滴式数字PCR定量检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其昀新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法SN/T2584水稻及其产品中转基因成分检测实时荧光PCR法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1转基因transgene将物种本身不具有的、来源于其他物种的功能DNA序列，通过生物工程技术，使其在该物种中进行表达，以便使该物种获得新的品种特征。3.2微滴式数字PCRdropletdigitalPCR在传统PCR扩增前对样品进行微滴化处理，将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴不含或含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。3.3SPS基因SucrosePhosphateSynthasegene蔗糖磷酸盐合成酶基因（SucrosePhosphateSynthasegene）。该基因可用于判定水稻的物种特异性，在水稻单倍体基因组中为单拷贝。3.4品系特异基因EventSpecificGeneDB34/T2816—20172利用生物工程技术转入的其他生物基因，使该生物品种表现新的生物学性状。3.5定量检测Quantitativedetection本标准中所述“定量”及“含量”指样品DNA中品系特异性基因拷贝数与SPS基因拷贝数之比。4方法和原理对于已知或经检测为转基因水稻品系Bt汕优63的样品，采用微滴式数字PCR双通道法，在同一反应管内同时扩增SPS基因与品系特异性基因，依据检测所得样品DNA溶液中的品系特异性基因拷贝数与水稻物种特异性基因（SPS基因拷贝数）之比，得到样品中转基因水稻品系Bt汕优63的含量。5仪器设备和主要试剂耗材5.1仪器设备微滴发生与分析系统，PCR仪，样品粉碎仪或研磨机，天平（感量0.01g），水浴锅或恒温孵育器，冷冻离心机，高压灭菌锅，涡旋振荡器，生物安全柜，pH计，核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计，微量移液器（2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL），8道移液器（20～200μL）。5.2主要试剂耗材微滴式数字PCR系统配套试剂及耗材，包括2×ddPCR反应预混夜，微滴发生油，微滴分析油，微滴发生板，胶条，铝覆膜，PCR反应板等。引物和探针由商品化公司生产。6检测步骤6.1取样和制样按照GB/T19495.7中规定的方法执行。6.2样品DNA的提取与纯化按照GB/T19495.3附录C中CTAB法或采用具有相同效果的DNA磁珠提取试剂盒进行DNA提取。6.3DNA浓度测定和定量样品DNA用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测定260nm和280nm处吸收值，分别计算核酸的纯度和浓度，计算公式如下：——DNA纯度以OD260/OD280比值表示。——DNA浓度=50×OD260mg/mL。DNA的纯度比值应在1.7～1.9之间，浓度调整至50～100ng/L。6.4微滴式数字PCR扩增DB34/T2816—20173样品经SN/T2584方法检测判定为转基因水稻品系Bt汕优63后，用微滴式数字PCR法进行检测。6.4.1引物与探针序列见表1。表1检测所需引物和探针引物/探针序列（5’-3’）产物大小(bp)SPS基因ForwardATGAGATGTCCGCTGGCAATG109ReverseTCTGACTGCTTGTGATGCTTGGProbeHEX-AAGCGTCCTCACCACTGTCCTGAAGC-BHQ1Bt汕优63品系特异序列ForwardAGAGACTGGTGATTTCAGCGGG119ReverseGCGTCCAGAAGGAAAAGGAATAProbeFAM-ATCTGCCCCAGCACTCGTCCG-BHQ16.4.2PCR反应体系见表2。表2微滴式数字PCR反应体系名称终浓度2×ddPCRSupermixforProbe1×SPS-F800nMSPS-R800nMSPS-P500nMBt汕优63品系特异序列-F800nMBt汕优63品系特异序列-R800nMBt汕优63品系特异序列-P500nMDNA模板100～300ng超纯水补足至22L注：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。6.4.3微滴发生反应体系配制好后，加入微滴发生板的样品孔中（避免产生气泡），在相应微滴发生板的油孔中加入70μL微滴发生油，装好胶条，置于微滴发生器中形成微滴。之后，将发生好的微滴用8道移液器转移至0.2mLPCR反应管中（缓吸缓放），用配套铝箔加热封口后，置于PCR仪上进行PCR反应。6.4.4微滴式数字PCR反应程序微滴式数字PCR反应参数为：95℃/10min；94℃/30s，60℃/60s，45个循环；98℃/10min。Ramprate1℃/s。注：以上参数可根据不同型号PCR仪和反应体系作适当调整。6.4.5仪器检测通道的选择DB34/T2816—20174设置PCR反应管荧光信号收集条件，应与探针标记的报告基团一致。具体设置方法可参照仪器使用说明书。6.4.6实验对照的设立每次检测必须设立3个对照：——阳性对照，为水稻转基因品系Bt汕优631％标准品基因组DNA；——阴性对照，非转基因水稻基因组DNA；——空白对照，PCR反应的空白对照（以水代替DNA模板）。7结果分析与计算7.1质量控制7.1.1每个样品设置2个提取平行重复，每个提取平行重复设定4个扩增平行重复。7.1.2每个反应管中的微滴发生总数必须大于9000个。7.1.3三个对照的扩增结果应当符合以下条件：——空白对照：品系特异基因、SPS基因均没有扩增；——阴性对照：品系特异基因没有扩增，SPS基因有扩增；——阳性对照：品系特异基因和SPS基因均有扩增。上述指标有一项不符合者，说明PCR反应不正常，应分析原因调整后重做。7.1.4每个提取平行重复样的4次测试结果中剔除相对标准偏差昀大的一个数值，其余3个数值取平均值作为该平行重复样的测得值。7.2结果计算7.2.1提取平行重复样中转基因水稻品系Bt汕优63成分含量7.2.1.1每管中转基因水稻品系Bt汕优63成分（S）含量计算公式（1）如下：100YXiS（％）＝％...................................(1)式中：X——品系特异性序列拷贝数Y——内源基因拷贝数7.2.1.2每个提取平行重复样中转基因水稻品系Bt汕优63成分含量（Ai）如公式（2）：Ai=（S1+S2+S3）/3....................................(2)7.2.2样品中转基因水稻品系Bt汕优63成分含量样品的转基因水稻品系Bt汕优63成分含量（T）为2个提取平行重复样品的转基因成分含量Ai平均值，公式（3）如下：T（％）=（A1+A2）/2...................................(3)8结果表述DB34/T2816—20175该样品中检出转基因水稻Bt汕优63品系，含量为×××％。9定量下限本标准所述方法的定量检测下限为0.1％。_________________________________