DB34T 2996-2017 猪链球菌检验操作规程

ICS 11.220B41DB34安徽省地方标准DB34/T2996—2017猪链球菌检验操作规程ProtocolofexaminationforStreptococcussuis文稿版次选择2017-12-30发布2018-01-30实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T2996—2017I前  言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽农业大学、安徽浩翔农牧有限公司提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽农业大学、安徽浩翔农牧有限公司、合肥市动物疫病预防控制中心、东至县畜牧兽医局。本标准主要起草人：李郁、孙裴、高亚飞、黄晓慧、何宗来、吴华健、魏建忠、王希春、郑新勇、钱昌银。DB34/T2996—20171猪链球菌检验操作规程1范围本标准规定了猪链球菌检验的设备和材料、检验程序、操作步骤、结果报告、废弃物无害化处理与人员安全防护。本标准适用于猪链球菌的检验。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.28食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求GB19489实验室生物安全通用要求SN/T2025动物检疫实验室生物安全操作规范SN/T2984检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则3主要设备和材料3.1显微镜：物镜10倍～100倍。3.2电子天平：感量0.1g。3.3培养箱：36℃±1℃。3.4冰箱：2℃～10℃。3.5全自动细菌鉴定系统。3.6pH计、pH比色管或精密pH试纸。3.7饱和氯化钠溶液：见附录A中A.1。3.830％甘油缓冲盐水溶液：见附录A中A.2。3.9革兰氏染色液：按照GB4789.28的规定执行。3.10姬姆萨染色液：按照GB4789.28的规定执行。3.11荚膜染色液：按照GB4789.28的规定执行。3.12血液琼脂培养基：按照GB4789.28的规定执行。3.13选择性普通绵羊血琼脂培养基：见附录A中A.3。3.14选择性THB肉汤：见附录A中A.4。3.15磷酸盐缓冲液（PBS）：按照GB4789.28的规定执行。3.16过氧化氢试剂：按照GB4789.28的规定执行。3.17糖发酵培养基：按照GB4789.28的规定执行。3.18醇发酵培养基：按照GB4789.28的规定执行。3.19七叶苷培养基：按照GB4789.28的规定执行。3.20马尿酸钠培养基：按照GB4789.28的规定执行。DB34/T2996—201724检验程序猪链球菌检验程序见图1。图1猪链球菌检验程序5操作步骤5.1采样、运输和保存5.1.1对病猪，最急性和急性病例可无菌采集死亡猪的心、肝、肺、肾、脾、淋巴结等组织，慢性病例如关节炎型一般采取关节液及周围组织；对活猪，可采取扁桃体拭子、鼻腔拭子。5.1.2脏器组织样品采集后需延迟送检的，可保存于饱和氯化钠溶液或30％甘油缓冲盐水溶液中，保存时间不超过72h。5.1.3样品均需采取低温（4～8℃）保存和运输。5.2显微镜检查5.2.1采集的样品制成触片，革兰氏染色，镜检。5.2.2猪链球菌形态学特征：革兰氏阳性球菌，菌体直径约1m，链状排列，链长短不一，链的长短常与细菌的种类及生长环境有关，固体培养物以双球菌为多，少量呈3个～5个排列的短链，液体培养物以链状为主，无芽孢，能形成荚膜。5.3分离培养5.3.1送检菌株的分离划线接种于血液琼脂平板，36℃±1℃培养24h±2h，如菌落生长缓慢，可延长至48h±2h，使之形成单个菌落，以供鉴定用。DB34/T2996—201735.3.2病料的分离和触片检查用经火焰灭菌并冷却的接种环蘸取病料内部组织后划线接种于血液琼脂平板，于36℃±1℃培养24h±2h，如菌落生长缓慢，可延长至48h±2h后观察。同时取病料做组织触片，姬姆萨染色后镜检，如见球菌则表明病料中可能含有链球菌。5.3.3扁挑体和鼻腔拭子的分离扁桃体和鼻腔拭子样品加入到含有5mL灭菌选择性THB增菌液的试管中，于36℃±1℃培养24h±2h后，划线接种于选择性普通琼脂绵羊血平板。5.3.4动物产品的均质、增菌和分离以无菌操作取检样25g，加入装有225mL灭菌选择性THB增菌液的广口瓶内，均质，于36℃±1℃培养24h±2h后，划线接种于选择性普通琼脂绵羊血平板。5.3.5在血液琼脂平板和选择性普通琼脂绵羊血平板上菌落特征圆形、微凸、表面光滑、湿润、边缘整齐、半透明的菌落，直径约0.3～1.0mm。5.4生化反应试验经初步鉴定后，做5％乳搪、海藻糖、七叶苷、甘露醇、山梨醇、马尿酸钠等糖发酵试验。猪链球菌发酵5％乳糖和海藻糖产酸，发酵七叶苷，不发酵甘露醇和山梨醇，不水解马尿酸钠。或应用全自动细菌鉴定系统进行生化反应试验。5.5动物试验5.5.1猪链球菌对小鼠、斑马鱼最敏感，均有致病力。5.5.2小鼠模型：将肺、脑、脾、肝、淋巴结磨碎，用灭菌生理盐水制成1:5组织悬液，或将24h的肉汤纯培养物用于动物试验。小鼠皮下注射组织悬液0.2mL或纯培养菌液0.1mL，接种后小鼠出现精神萎顿、拱背、毛乱、停食，3d～7d死亡；死亡的小鼠脾脏肿大，肺脏和肝脏出血。以死亡小鼠内脏组织制成触片，革兰氏染色，镜检，可见猪链球菌；同时在血液琼脂平板或选择性普通琼脂绵羊血平板上作分离培养，可见猪链球菌的典型菌落。5.5.3斑马鱼模型：将肺、脑、脾、肝、淋巴结磨碎，用灭菌生理盐水制成1:5组织悬液，或将24h的肉汤纯培养物用于动物试验。斑马鱼腹腔注射组织悬液10µL或纯培养菌液5µL，接种后观察4d，一般1d～4d死亡。以死亡斑马鱼内脏组织制成触片，革兰氏染色，镜检，可见猪链球菌；同时在血液琼脂平板或选择性普通琼脂绵羊血平板上作分离培养，可见猪链球菌的典型菌落。5.6猪链球菌PCR鉴定见附录B。5.7猪链球菌PCR血清型鉴定见附录B。6结果报告6.1符合5.2、5.3、5.4、5.5，可确定为猪链球菌。DB34/T2996—201746.2符合5.3、5.6，可确定为猪链球菌。6.3符合6.1、6.2，且根据5.7，可确定为某种血清型的猪链球菌。7废弃物无害化处理与人员安全防护7.1猪链球菌是属于链球菌属的一种细菌，根据其荚膜多糖的抗原差异，可分为1～34及1/2共35个血清型。大多数致病性菌株为1～9血清型，其中猪链球菌2型为最常见和毒力最强的血清型，不仅对猪致病性很强，而且可以感染特定的人群，是一种重要的人畜共患病病原菌。7.2应按照GB19489、SN/T2984和SN/T2025的规定执行。DB34/T2996—20175AA附录A（规范性附录）培养基的配制A.1饱和氯化钠溶液A.1.1成分氯化钠38～39g蒸馏水100mLA.1.2制法将38～39g氯化钠加入100mL蒸馏水中，充分搅拌，待完全溶解混匀后，分装于采样管，每管5～10mL，121℃高压灭菌15min备用。A.230％甘油缓冲盐水溶液A.2.1成分氯化钠0.5g碱性磷酸钠1.0g中性甘油30mL蒸馏水100mLA.2.2制法先将盐类成分溶于水中，然后加入甘油，混匀，分装于采样管，每管5～10mL，121℃高压灭菌15min备用。A.3选择性普通绵羊血琼脂培养基A.3.1成分蛋白胨10.0g牛肉膏3.0g氯化钠5.0g蒸馏水1000mLA.3.2制法将A.3.1中各成分溶于蒸馏水中，加热溶解，校正pH至7.3±0.2，121℃灭菌20min，待冷却至50℃左右时加50mL无菌脱纤维绵羊血，摇匀后倒平板。A.4选择性THB肉汤DB34/T2996—20176A.4.1成分THB培养基30g多粘菌素10mg萘啶酮酸15mg蒸馏水1000mLA.4.2制法将A.4.1中THB培养基溶于蒸馏水中，加热溶解，121℃灭菌20min，待冷却至50℃左右，加入多粘菌素10mg、萘啶酮酸15mg，摇匀后倒平板。DB34/T2996—20177BB附录B（规范性附录）猪链球菌及1、2、7、9型聚合酶链式反应（PCR）鉴定B.1材料准备B.1.1主要仪器PCR扩增仪、1.5mL离心管、0.2mLPCR反应管、水浴锅、高速冷冻离心机、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、移液器吸管。B.1.2主要试剂2×PCRMasterMix、灭菌超纯水、琼脂糖、10mg/ML溴化乙锭（EB）、TBE缓冲液、上样缓冲液（10×LoadingBuffer）、相对分子质量Marker（DL-2000）。B.1.3引物序列见表B.1。表B.1检测主要毒力基因的引物检测基因引物名称引物序列(5'-3')产物大小/bpgdhgdh-1gdh-2GCAGCGTATTCTGTCAAACGCCATGGACAGATAAAGATGG688cps1Icps1I-1cps1I-2GGAATAAAGCGGAGTACAGCGTCCTGCACGGTATTAATTGC210cps2Jcps2J-1cps2J-2CAAACGCAAGGAATTACGGTATCGAGTATCTAAAGAATGCCTATTG675cps7Hcps7H-1cps7H-2GGAAAGAGACACGTTGGTATCGGACACGTAAAGACTGACTAG395cps9Hcps9H-1cps9H-2GGCTACATATAATGGAAGCCCCCGAAGTATCTGGGCTACTG390B.2操作步骤B.2.1细菌基因组DNA的提取采用煮沸法。即取1mL过夜培养菌液加入1.5mL离心管中，以12000r/min离心5min，弃上清液，加入30µL灭菌超纯水混均，置沸水中煮沸10min，之后冰浴5min，再以12000r/min离心5min，取上清液即为DNA模板。B.2.2PCR扩增DB34/T2996—20178检测过程应同时做阳性和阴性空白对照。阳性对照模板为猪1、2、7、9型链球菌，阴性空白对照为灭菌超纯水。PCR反应体系：总体积为25µL，其中含有12.5µL的PCRMasterMix，10μmol/L上、下游引物各1µL，1μg/LDNA模板5µL，灭菌超纯水5.5µL。PCR反应条件见表B.2。表B.2PCR反应条件检测基因预变性温度/时间℃/min变性温度/时间℃/s退火温度/时间℃/s延伸温度/时间℃/s循环数延伸温度/时间℃/mingdh94594605560726035727cps1I955944056457260307210cps2J955955056507250357210cps7H955944056457260307210cps9H955943056307230357210B.2.3PCR扩增产物电泳检测用100ML1×TAE缓冲液制备1.0%琼脂糖凝胶，加入5µL10mg/MLEB。取5μLPCR扩增产物与1μL10×LoadingBuffer混合后加入点样孔进行电泳，电压100V，电流100A，电泳30min。用凝胶成像仪观察、拍照、记录电泳结果。B.2.4结果判定猪链球菌的目的基因大小为688bp，1、2、7、9型目的基因大小分别为210、675、395、390bp。阳性对照扩增出目的基因条带的大小，阴性空白对照孔未见有PCR扩增条带，表明试验成立，否则应重做。试验成立，被检样品孔如发现有688、210、675、395、390bp大小的扩增条带，则判定阳性（＋），猪链球菌及1、2、7、9型PCR检测结果电泳图见图B.1、图B.2、图B.3、图B.4、图B.5；被检样品孔如未发现有目的条带大小的扩增条带，则判为阴性（－）。图中：1：DNAMarker2000；2：阳性对照；3：阴性对照；4、5：检测样品。图B.1猪链球菌PCR检测结果电泳图12345688bp20001000750500250100DB34/T2996—20179图中：1：DNAMarker600；2：阳性对照；3：阴性对照；4、5：检测样品。图B.2猪链球菌1型PCR检测结果电泳图图中：1：DNAMarker