DB34T 2997-2017 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌检验操作规程

ICS 11.220B41DB34安徽省地方标准DB34/T2997—2017猪传染性胸膜肺炎放线杆菌检验操作规程ProtocolofexaminationforActinobacilluspleuropneumoniae文稿版次选择2017-12-30发布2018-01-30实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T2997—2017I前  言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽农业大学、安徽浩翔农牧有限公司提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽农业大学、安徽浩翔农牧有限公司、安徽杜洛克种猪育种有限责任公司、颍上庆丰农牧发展有限公司。本标准主要起草人：孙裴、李郁、高亚飞、黄晓慧、崔文竹、魏建忠、殷宗俊、赵顾、张晓东、王希春。DB34/T2997—20171猪传染性胸膜肺炎放线杆菌检验操作规程1范围本标准规定了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的检验的设备和材料、检验程序、操作步骤、与副猪嗜血杆菌鉴别、结果报告。本标准适用于猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的检验。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.28食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求GB14922.2实验动物微生物学等级及监测NY/T537猪放线杆菌胸膜肺炎诊断技术SN/T1447猪传染性胸膜肺炎检疫技术规范3主要设备和材料3.1显微镜：物镜10倍～100倍。3.2电子天平：感量0.1g。3.3恒温培养箱3.4冰箱：2℃～5℃，-20℃。3.5无菌培养皿：直径90mm。3.6无菌试管：15mm×150mm。3.7无菌锥形瓶：容量250mL，500mL。3.8pH计或pH比色管或精密pH试纸。3.9鸡表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌。3.10灭菌棉拭子。3.11革兰氏染色液：按照GB4789.28的规定执行。3.12鲜血平板培养基：制备方法见附录A中A.1。3.13营养琼脂培养基：按照GB4789.28的规定执行。3.14尿素琼脂培养基：按照GB4789.28的规定执行。3.15改良TSB肉汤培养基：制备方法见附录A中A.2。3.16改良TSA培养基：制备方法见附录A中A.3。3.17巧克力琼脂培养基(CA)：制备方法见附录A中A.4。3.18改良PPLO琼脂培养基(mPPLO)：制备方法见附录A中A.5。3.19糖发酵培养基：按照GB4789.28的规定执行。3.20ONPG培养基：按照GB4789.28的规定执行。DB34/T2997—201723.21缓冲葡萄糖蛋白胨水：按照GB4789.28的规定执行。3.22蛋白胨水：按照GB4789.28的规定执行。3.23硫酸亚铁琼脂：按照GB4789.28的规定执行。3.24硝酸盐培养基与硝酸盐还原试剂：按照GB4789.28的规定执行。3.25氧化酶试剂：按照GB4789.28的规定执行。3.26Rustigian氏尿素培养液：按照GB4789.28的规定执行。3.27无菌PBS溶液：制备方法见附录A中A.6。4检验程序猪传染性胸膜肺炎放线杆菌检验操作程序见图1。图1猪传染性胸膜肺炎防线杆菌检验操作程序5操作步骤5.1采样、运输和保存5.1.1病料的采集标准应符合SN/T1447的相关规定。DB34/T2997—201735.1.2活体样品采集用无菌棉拭子伸入鼻腔采集分泌物，放人无菌试管中立即送往实验室供分离。5.1.3组织样品的采集无菌采集具有典型病变的肺脏、肺门淋巴结、扁桃体等器官和鼻腔分泌物，并在死亡2h内完成。5.1.4血样的采集制备无菌操作采集动物血，每头不少于10mL。自然凝固后无菌分离血清，分装，加盖密封后4～8℃保存。5.1.5样品运送采集的样品，均应在4～8℃条件下24h内送到实验室。脏器组织样品采集后延迟送检的，可保存于饱和氯化钠溶液或30％甘油缓冲盐水溶液中，保存时间不超过72h。5.2显微镜检查5.2.1采集的样品制成触片，革兰氏染色，镜检。5.2.2猪传染性胸膜肺炎放线杆菌形态学特征：革兰氏阴性小球杆菌或纤细的小杆菌，直径0.5～2nm，长度60～450nm。有荚膜和菌毛，不形成芽孢且无鞭毛，有的成双排列。新鲜病料中常呈两极着色，人工培养24～96h可见到丝状菌。5.3分离培养5.3.1对没有受污染的新鲜病料用经火焰灭菌并冷却的接种环蘸取病料内部组织后划线接种于在血琼脂或改良TSA培养基上，于36℃±1℃培养24h±2h，如菌落生长缓慢，可延长至48h±2h后观察。或无菌接种于改良TSB肉汤于37℃培养24h后，无菌操作将肉汤培养液划线接种于血琼脂或改良的TSA培养基上，37℃培养24h。5.3.2如被检样品腐败或污染，可在上述培养基中加入洁霉素（1ug/mL）、杆菌肽（100ug/mL）、制霉菌素（50ug/mL），抑制其他杂菌生长。5.3.3在改良TSA培养基上菌落特征：圆形、边缘整齐、表面光滑湿润、灰白色、半透明、针尖大小、凸起、露珠样。5.3.4在血琼脂培养基上菌落特征：乳白色、露珠状、中间微隆起、呈β-溶血。5.3.5在巧克力培养基上菌落特征：针尖大小、约2～3mm大小，灰白色、圆形隆起、闪光不透明。5.3.6卫星现象：取纯化后的单菌落划线接种于改良TSA培养基，再垂直于接种线水平划线接种金黄色葡萄球菌，37℃恒温培养箱中培养24h后，可见在分离菌和金黄色葡萄球菌划线交叉处细菌菌落生长较好，距离交叉处越远细菌生长越差，呈“卫星现象”生长。5.4生化反应试验能分解木糖、甘露醇、葡萄糖、甘露糖、蔗糖、果糖和麦芽糖，不能分解乳糖、七叶苷、山梨醇、棉子糖、阿拉伯糖和鼠李糖。ONPG试验、尿素酶试验、硫化氢试验、硝酸盐还原试验阳性，靛基质试验、甲基红试验、V-P试验和氧化酶试验均为阴性。5.5动物回归试验DB34/T2997—201745.5.1猪传染性胸膜肺炎放线杆菌对小鼠、大鼠、豚鼠、家兔均有致病力，其中以小鼠最为敏感。试验所需的实验动物的等级可按照GB14922.2的规定选择。5.5.2将肺、肝、脾、淋巴结和扁桃体磨碎，用无菌PBS制成1:5～1:10组织悬液，或将24h的肉汤纯培养物做动物试验用。小鼠腹腔注射组织悬液0.2mL或纯培养菌液0.1mL，接种后小鼠出现轻微跛行，食欲减退甚至废绝，身体蜷缩，呼吸急促并伴有抽搐，精神沉郁，小鼠死亡前出现严重昏迷及呼吸困难。死亡小鼠的气管和支气管充满泡沫血色粘液分泌物；肺充血、出血，肺泡间质水肿，同时伴有纤维素性胸膜肺炎等症状，肝部肿大。以死亡小鼠的心血或脏器制成涂片，革兰氏染色，镜检，可见猪传染性胸膜肺炎放线杆菌；同时在血琼脂培养基或改良TSA培养基上作分离培养，可见猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的典型菌落。5.6PCR鉴定见附录B。5.7血清型鉴定若需鉴定血清型时可按照NY/T537的规定执行。6猪传染性胸膜肺炎放线杆菌与副猪嗜血杆菌鉴别猪传染性胸膜肺炎放线杆菌与副猪嗜血杆菌均为革兰氏阴性小杆菌，形态很相似，因此在鉴定中应注意区别，两种细菌的区别应符合表1的规定。表1猪传染性胸膜肺炎放线杆菌与副猪嗜血杆菌鉴别要点细菌种类溶血性CAMP尿素酶木糖甘露醇甘露糖青霉素最适动物模型猪胸膜肺炎放线杆菌++++++敏感小鼠副猪嗜血杆菌------抵抗豚鼠注1：+：阳性；注2：-：阴性；注3：CAMP：葡萄球菌可增强其溶血环。7结果报告7.1综合以上培养形态与染色特性，生化反应试验，动物回归试验，PCR鉴定，血清学分型鉴定及其与副猪嗜血杆菌的鉴别结果，进行报告。7.2符合5.2、5.3、5.4、5.5，可确定为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌。或符合5.3、5.6，可确定为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌。7.3符合7.1且根据5.7，可确定为某种血清型的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌。DB34/T2997—20175AA附录A（规范性附录）培养基的配制A.1血琼脂培养基（BA）A.1.1成分TSA–YE琼脂24.0g无菌绵羊血25mL超纯水500mLA.1.2制法将24.0gTSA–YE琼脂溶于500mL超纯水中，充分搅拌，待完全溶解混匀后，121℃高压灭菌20min。待培养基冷却至55℃左右时,以无菌方式添加无菌绵羊血，混匀，倾注无菌平皿，4℃保存备用。A.2改良TSB液体培养基A.2.1成分TSB–YE琼脂18.0g无菌小牛血清50μL/mL辅酶Ⅰ(NAD)10～30μL/mL超纯水500mLA.2.2制法将18.0gTSB–YE琼脂溶于500mL超纯水中，充分搅拌，待完全溶解混匀后，每管3mL或5mL分别分装于12×100和15×150规格的试管中，121℃高压灭菌20min。待培养基冷却至55℃左右时，每管均添加NAD(10～30μL/mL)以及无菌小牛血清(50μL/mL)，混匀，倾注倒平皿，4℃保存备用。A.3改良TSA培养基A.3.1成分TSA–YE琼脂24.0g无菌小牛血清25mL辅酶Ⅰ(NAD)5～15mL超纯水500mLDB34/T2997—20176A.3.2制法将24.0gTSA–YE琼脂溶于500mL超纯水中，充分搅拌，待完全溶解混匀后，121℃高压灭菌20min。待培养基冷却至55℃左右时，添加25mLNAD以及5～15mL无菌小牛血清，混匀，倾注倒平皿，4℃保存备用。A.4巧克力琼脂培养基(CA)A.4.1成分TSA–YE琼脂24.0g无菌绵羊血25mL超纯水500mLA.4.2制法将24.0gTSA–YE琼脂溶于500mL超纯水中，充分搅拌，待完全溶解混匀后，121℃高压灭菌20min。待培养基冷却至80℃左右时,以无菌方式添加无菌绵羊血，混匀，倾注无菌平皿，4℃保存备用。A.5改良PPLO琼脂培养基A.5.1成分PPLO琼脂34.0g葡萄糖1.0g酵母提取物10g无菌小牛血清50mL辅酶Ⅰ(NAD)10～30mL超纯水1000mLA.5.2制法将34.0gPPLO琼脂、1.0g葡萄糖、10g酵母提取物溶于1000mL超纯水中，充分搅拌，待完全溶解混匀后，121℃高压灭菌20min。待培养基冷却至55℃左右时,添加50mLNAD以及10～30mL无菌小牛血清，混匀，倾注无菌平皿，4℃保存备用。A.6无菌PBS溶液A.6.1成分十二水合磷酸氢二钠1.5g氯化钾0.1g氯化钠4.0g磷酸二氢钾0.1g蒸馏水500mLDB34/T2997—20177A.6.2制法将1.5g十二水合磷酸氢二钠、0.1g氯化钾、4.0g氯化钠、0.1g磷酸二氢钾溶于500mL超纯水中，充分搅拌，待完全溶解混匀后，121℃高压灭菌20min，保存备用。DB34/T2997—20178BB附录B（规范性附录）猪传染性胸膜肺炎放线杆菌聚合酶链式反应（PCR）鉴定B.1仪器设备和材料B.1.1主要仪器PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、恒温振荡培养箱、超净工作台、水浴锅、高速冷冻离心机、电热压力蒸汽灭菌器、移液器。B.1.2主要试剂2×TaqPCRMasterMix、分子量指示物（100bp～600bpDNAMarker）、超纯水、琼脂糖、10mg/mL溴化乙锭（EB）、Tris-乙酸电泳缓冲液(TAE)、１×TAE使用液、1.0％琼脂糖凝胶。B.1.3引物序列上游引物：5′-GATAAACCTTTTCCGGAATT-3′下游引物：5′-TACCACACCGTGTTTATCAA-3′B.2操作步骤B.2.1细菌基因组DNA的提取采用煮沸法。即：1)取1mL过夜培养菌液加入1.5mL离心管中，以12000r/min离心5min；2)弃上清液，加入50µL超纯水混匀；3)置沸水中煮沸10min，再冰浴5min；4)重复步骤③；5)再以12000r/min离心5min，取上清液即为DNA模板。B.2.2PCR扩增检测过程应同时做阳性和阴性空白对照。阳性对照模板为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌，阴性空白对照为灭菌超纯水。PCR反应体系：总体积为25µL，其中含有12.5µL的2×TaqP